格子ライトシート顕微鏡法に適用されるさまざまなパターンの定量的分析

Nature Communications volume 13、記事番号: 4607 (2022) この記事を引用

3472 アクセス

2 引用

25 オルトメトリック

メトリクスの詳細

ライトシート顕微鏡は、広視野顕微鏡や共焦点顕微鏡と比較して、光毒性とバックグラウンドを軽減し、イメージング速度を向上させます。ただし、ガウスビームを装備した場合、ライトシート顕微鏡の軸方向の分解能と観察可能な視野は反比例の関係になります。ディザリングされた光学格子に基づくライトシートは、軸方向に構造化された照明パターンを使用することにより、ガウスビームと比較して軸方向の解像度とビームの均一性を向上させます。ただし、これらの利点は、試料への総照明の増加と照明パターンの軸方向の閉じ込めの減少を犠牲にして得られます。固定セルと生セルでのシミュレーションと実験測定を使用して、ビーム均一性、軸方向解像度、横方向解像度、光退色に関するガウスライトシートと格子ライトシートの違いを定量化します。軸方向の解像度または光学的セクショニングのいずれかを優先するために、さまざまな光学格子照明パターンをどのように調整できるかを示します。最後に、相補的な光学特性を持つさまざまな格子ライトシートパターンの連続取得をスペクトル的に融合して、高解像度と低背景画像の両方を実現するアプローチを紹介します。

過去 20 年にわたり、ライトシート顕微鏡は、単一分子から生物全体に至るまで、さまざまなスケールの生体サンプルの画像化に使用されてきました 1、2、3、4。ライトシート顕微鏡法は、標本の薄い平面のみを照明します。これにより、落射蛍光顕微鏡や共焦点顕微鏡と比較して、焦点の合っていない照明が最小限に抑えられ、光退色が軽減され、信号対雑音比 (SNR) が向上します。さらに、蛍光顕微鏡法では、全体の点像分布関数 (PSF) は励起 PSF と検出 PSF の両方の積です。したがって、照明パターンが検出被写界深度に匹敵するか、それよりも薄い場合、単一平面照明でも軸方向の解像度を高めることができます。共焦点のような点走査法も軸方向の分解能と光学的切断を向上させますが、広視野検出を備えた平面照明により、光退色が劇的に低下し、イメージング速度が 100 ～ 1000 倍高速になります 5。

ライトシート顕微鏡の最も一般的な実装では、シリンドリカルレンズを使用して、標本におけるガウス軸強度プロファイルを備えた横方向に延びるシートにガウスビームを集束させます。このアプローチでは、ライトシートの厚さとその伝播長の間に固有のトレードオフが生じます。ガウスライトシートを薄くすると、軸方向の分解能と光学的セクショニングが向上しますが、その代償として伝播長が短くなり、視野が狭くなります。対照的に、より厚いガウスライトシートはより広い領域を画像化できますが、解像度と光学的セクショニングは低くなります。これらのトレードオフを克服するために、多くのグループが、ベッセルビーム 6、7、エアリービーム 8、9、光格子 2、10 などの構造化ライトシートを照明に使用して、ビームの伝播長から軸方向の解像度を切り離すことを提案しています。実際には、そのような理想的な非回折ビームは無限のエネルギーを必要とし、物理的に実現することはできません。代わりに生成されるのは、ガウスビームと非回折ビーム（ベッセルガウスや格子ガウスなど）のハイブリッドであるビームで、照明パターンは軸方向に分布する減衰包絡線によって境界付けられ、照明エネルギーを単一の平面の周囲に閉じ込めます。標本。サンプルでの減衰エンベロープの幅を変えるか、または同様に、励起対物レンズの後部焦点面での照明の強度分布を kz (検出対物レンズの軸方向でもある) に沿って広げることで、ユーザーは特性を調整できます。生体サンプルとイメージングの目的に応じて、伝播長、軸方向の分解能、または光学的セクショニングを有利にするために照明パターンを調整します。

最近の 2 つの論文 11、12 では、シミュレーション 11 と実験 12 (非生物学的) 測定の両方を使用して、ガウスビームと比較した非回折ビームの特性を調査しました。驚くべきことに、これらの論文は、正方光格子 (最も一般的に使用される格子ライトシート実装の 1 つ) がガウスビームと同様のビームウェスト、PSF、光伝達関数 (OTF) を持ち、集束ガウスビームと正方光格子を利用する機器は、互いに区別がつかないように実行する12. これらの発見は以前の出版物2や私たち自身の以前の経験と矛盾しているように見えたので、私たちはこれらの主張の原因を調査し、ガウスビームと格子ライトシートの間の利点とトレードオフをより完全に特徴づけようと努めました。この目的に向けて、私たちは回折限界ビーズやさまざまな細胞構造に関する光学シミュレーションと実験的測定の両方を使用します。我々は、サンプルでの境界エンベロープ (入力瞳での NA 広がり) を変化させることによって、構造化ライトシートがより格子状またはガウス状に動作するように調整できることを実証します。同じ伝播長のライトシートを比較し、PSF と OTF を測定し、フーリエ平面相関 (FPC)13 を実行して、ビーム伝播長に沿った複数の位置における画像内の空間周波数相関を評価しました。我々は、ガウスビームと比較して、正方形と六角形の格子ライトシートの両方が、(1) ビーム焦点における軸方向の解像度が高く、(2) ビーム伝播の大部分にわたってこの高い解像度を維持することを実証します。どちらの場合も、これらの利点には、メインビームの両側にあるサイドローブのエネルギーが大きくなるというトレードオフが伴い、その結果、試料への総エネルギー線量が増加し、光学的セクショニングが減少します。これを考慮して、固定標本と生きた標本の両方を内因性タンパク質レベルでイメージングする際のガウス、正方格子、六方格子ライトシートの解像度、光退色、光毒性のトレードオフを特徴付け、ライトシートパラメータを最適に調整する方法について提案します。与えられた生物学的サンプル。最後に、ライトシートを使用して取得した画像を相補的な光学特性と組み合わせるアプローチとして、スペクトル重み付け画像融合を紹介します。

接着細胞のイメージングに最適化された長さ 20 μm のライトシートを調査することから特性評価を開始します。本稿の残りの部分で使用される座標系の表記を図 1a に示します。伝播方向 y に沿った強度プロファイルの半値全幅 (FWHM) によってビーム長を定義します (図 1b、c)。光セクショニングに基づくものなど、伝播長を説明するための他の指標11も同様の結果を与えることに注意してください（表S1および図S1a）。さまざまなライトシートの光学的断面を定量化するために、励起軸プロファイルと、ビーム中心と伝播長FWHMの両方での軸方向に沿った累積強度の両方もプロットしました（図1d、e）。まず、NA 0.21 のガウスビーム、NA = 0.35/0.25 (それぞれ最大 NA と最小 NA) の MB 正方格子、および NA = 0.46/0.36 の六方格子を比較しました。ガウスビームの場合、シグマ、ビームの厚さ、伝播長の間には独特の関係があります 14。 MB 正方格子ビームと六方格子ビームの場合、最小 NA と最大 NA の差 (ΔNA)、つまりサンプル面に課せられる減衰エンベロープ (Δkz での Δkz瞳）、および MB 正方ベッセル配列の間隔（瞳での ∆kx）。各ビームタイプに対するこれらのパラメータの影響については、次のセクションで説明します。ここでは、以前に行ったように、MB 正方格子ビームと六方格子ビームの両方で 0.1 の一定の ΔNA を維持し、側面ビームレットが内側の境界環のすぐ外側になるように MB 正方格子間隔を選択しました 2。全体的なPSFの軸方向FWHM（六方格子の場合は1.18λ、MB-正方形の場合は1.62λ）を比較することによって測定されたように、MB正方形格子と六方格子の両方で、同じ伝播長のガウスビーム（図1f、h）と比較して軸分解能が向上しました（図1f、h）。格子、ガウスの場合は 1.83λ、表 S2)。これらの違いは、ビーム焦点から離れた全体のPSFを比較すると、たとえば伝播プロファイルFWHM（この状況ではビーム焦点から10ミクロン離れています）で比較するとさらに顕著になりました（図1g、i）。この位置での PSF 全体の軸方向の FWHM は、六方格子では 1.27 λ、MB 正方格子では 1.6 λ、ガウスビームでは 2.43 λ でした。「方法」で定義されたメインローブの厚さのプロットにより、これらの結果が確認され、MB 正方格子と六方格子ライトシートの両方のメインローブの厚さの値は 22 λ までのビーム伝播長全体にわたってほぼ一定のままである一方、ガウスのメインローブの厚さは 2 λ 増加することが示されています。この範囲を超えて折ります（図S1a）。また、ここで各ビームに対してこれらの結果を実験的に再現し、光学シミュレーションと非常によく一致することを実証しました（図S2）。これらの結果を総合すると、ガウス格子ライトシート、MB 方形格子ライトシート、および六方格子ライトシート間の明確に区別できる違いが実証されています。 MB 正方格子および六方格子ライトシートは軸方向の解像度が高く、ガウスビームよりも伝播長のより広い部分にわたってこの解像度を維持します。最後の例として、マスクを使用して瞳面で均一な照明ストライプを切り取ることによって生成される、同じ長さのフラットトップビームを調査しました。これらのビームは、ガウスビームと MB 正方格子の中間の強度サイドローブを持つ Sinc 関数に似た電場をサンプルにもたらします。フラットトップビームは中間の特性を示し、ビーム焦点ではガウスと同様の軸方向分解能を示しましたが、ビーム伝播方向に沿った劣化は少なくなりました。トレードオフとして、フラットトップビームは軸方向の解像度が低くなりますが、すべての位置でMB正方形または六角形の格子ライトシートよりも優れた光学的セクショニングを実現しました（図S3eおよび表S2）。

a サンプルと瞳面の座標基準フレームを示す検出および励起対物レンズの概略図。 b 3 つの異なるビームのシミュレートされた yz 伝播プロファイル。0 はビーム焦点を示し、白い破線は伝播 FWHM、つまり強度が焦点でピークの 50% に低下する位置を示します。 c (b) の伝播方向に沿って z = 0 で切断された線。 d ビーム焦点（y = 0、上の行）およびビーム伝播に沿った半値全幅（FWHM）（y = 24λ、下の行）における、bに示す励起パターンのzに沿ったラインプロファイル。広視野検出 PSF は黒い破線で示されています。 e 3 つの異なるビームの累積 Z 軸励起エネルギープロファイル。プロットは、ビーム焦点 (y = 0、上の行) とビーム伝播に沿った FWHM (y = 24λ、下の行) で計算されます。 f、g 伝播中心 (y = 0) およびビーム伝播に沿った FWHM (y = 24λ) での 3 つの異なるビームの全体的な PSF。 h, i 線 x = 0 に沿った全体的な PSF の軸線プロファイル (f、g) に示されています。h はビームが伝播方向に沿って焦点を合わせているとき、i はビームが伝播方向に沿って FWHM にあるときです。方向。

ただし、MB正方格子、六方格子、およびフラットトップライトシートの軸方向分解能の向上はすべて、励起ビームのzプロファイルの閉じ込めの減少を犠牲にしています（図1eおよびS3b）。正規化された積分強度を z = 0 から軸方向に沿ってプロットすると、ガウスビームエネルギーがテストした他のタイプのライトシートと比較してより限定されていることがわかります。これは、累積強度の 63% が収まる半値幅として以前に定義された光学的セクショニング能力によって定量化できます 11。ガウスビームの光学セクションは 0.84 λ ですが、ここで検討した MB 正方格子と六方格子の場合は 1.87 λ と 3.42 λ です。 63％カットオフでは、フラットトップビームとガウスビームの光学的断面化は同様ですが（図S1a）、フラットトップビームとガウスビームのzプロファイル累積強度のプロットは、両方のカットオフでフラットトップビームの閉じ込めが減少していることを示しています。ビーム焦点と伝播長FWHM（図S3b）で、ライトシートの厚さと光学的セクショニングの値を定義するために単一のカットオフを選択するという課題を示しています。分解能の比較に関しては、同じ 3 つのビームで実験的に測定された励起 PSF は、シミュレーションと一致して、軸方向の分解能、伝播不変性、および軸方向の閉じ込めの間のこのトレードオフを確認しています (図 S2)。

最後に、実空間での比較では、解像度を完全に表現する能力には限界があります。たとえば、実空間の FWHM 測定は直感的ではありますが、システムによって効率的に送信される低空間周波数成分によって支配されます。これらの比較では、システムの観察可能な空間周波数帯域幅の変化が明確に捉えられておらず、標本から観察され、デコンボリューションによって再重み付けされる増加した情報内容も捉えられていません。これらの機能は、システムの OTF を比較することによって、周波数空間でより明確に実証できます。ガウスビーム、MB正方格子、および六角形格子のOTFを比較すると、ビーム焦点と伝播FWHMの両方で、ガウスビームよりもMB正方格子および六角形格子の軸方向OTFサポートが明らかに増加していることが明らかになりました（図2a〜f）。これらの比較では、OTF 軸は波数ベクトルの 2 倍である 4π/λ の分数としてプロットされます。特定の波長について、蛍光イメージングによって実現できる最大の空間周波数成分は、半径 4π/λ の球によって定義されます。 MB正方格子と六角形格子のOTFの大きさの比を等価長ガウスビームに対してプロットすると（図2b）、4π/λの30％から40％の軸周波数範囲にわたって、格子ライトシートは10-同等の長さのガウスビームよりも 100 倍高いサポート。これらの違いは、ビーム焦点から離れると（たとえば、伝播方向yに沿った強度プロファイルのFWHMで）さらに顕著になります（図2d）。

a ビーム焦点 (y = 0) における 3 つの異なるビームの OTF 振幅の対数スケールのシミュレーション画像。 b MB 正方格子ライトシートと六方格子ライトシートの OTF をビーム焦点 (y = 0) でのガウスビームの OTF で割った間の振幅比の対数スケール画像。 c、d 伝播方向（y = 24λ）の半値全幅における（a、b）との比較プロット。 e、f ビーム焦点（y = 0）および伝播FWHM（y = 24λ）における線kx = 0（aおよびcの赤線）に沿ったOTF振幅の軸方向プロファイル。

シミュレーションと実験データセットの両方で観察されたガウスビームと比較して、MB 正方格子と六方格子の解像度と均一性の点で明らかな利点が見られることを考慮して、なぜ以前の出版物 12 がこれらの違いを検出できなかったのかを理解しようと努めました。我々は、これは先行研究で格子ビームを定義および定量化するために使用されたパラメータの特定の選択、または測定に使用された特定の実験設定のいずれかに起因する可能性があると仮説を立てています。上で述べたように、MB 正方格子ビームと六方格子ビームには、すべて同じ伝播長を持つ、異なる特性を持つライトシートを生成できるように調整できる追加パラメーターがあります。たとえば、これらのビームのΔNA を増加 (または減少) できます。これは、より狭い (またはより広い) 減衰境界エンベロープをサンプルに適用することと同じです。その結果、ΔNA が大きい格子はよりガウス状になり、ΔNA が小さい格子はより格子状になります。所定の ΔNA の場合、この ΔNA が計算される中心 NA を変更することによって、所定の長さのビームを実現できます。中心 NA が低いほどビームは長くなり、中心 NA が高いほどビームは短くなります。

この効果を図 2 と図 3 で示します。 S4 と S5 はそれぞれ長さ 20 ミクロンの MB 正方形と六角形の格子です。 ΔNA と中心 NA を一緒に変化させることにより、これらの 20 ミクロンのビームは、軸方向の分解能が低く、軸方向の閉じ込めが良好なガウス状のビームから、軸方向の分解能と均一性は高いが閉じ込めが低い、より格子状のビームに移行します。周波数空間では、全体的な OTF は、広視野検出 OTF と励起 OTF の畳み込みです。励起パターンの中心 NA を増加させると、広視野検出 OTF のコピーが kz 軸に沿ってシフトされ、サンプルからのより高い空間周波数情報の観察が可能になります。 ΔNA を増やすと、kz 軸に沿ってこれらのシフトされたコピーが不鮮明になり、周波数空間がより完全に埋められ、光学的セクショニングが増加します。中心 NA が高く、ΔNA が小さい MB 正方格子の場合、拡張 OTF 次数をシフトして、OTF が kz = 0 を中心とする中心ローブによって支配されるようになる可能性があることに注意してください。これにより、実際のビームが発生します。よりガウスらしく見えるようにスペースを追加します (図 S4)。六方格子の場合、ΔNAが小さいことによるOTFサポート全体のディップは、励起プロファイルのサイドローブが大きくなり、軸方向の閉じ込めが小さくなります（図S5）。

MB 正方格子の場合、追加の調整パラメーターはマルチベッセルアレイの間隔であり、後部瞳内の 2 つのサイドビームレットの位置を決定します。これは技術的には自由なパラメータですが、2 つの側部ビームレットが内側の環状部に内接するようにビーム間隔を選択すると、最も均一なビームが達成されることがわかります。この特定の構成では、MB 正方格子の 4 つのビームレットすべてが同じ Δky を共有するため、試料での伝播長が同じになり、伝播方向に沿った非常に一貫した励起プロファイルが得られます。実際、マルチベッセルアレイの間隔を変えると、OTF サポートがよりガウス状のライトシートからより格子状のライトシートにシフトする可能性もあります。図S6に示されているように、マスクの内側の環によってクリップされるように2つのサイドビームレットを内側にシフトすると、PSF全体の軸方向のFWHMが減少し、励起プロファイルの変調が増加した、より六角形のライトシートが得られます（図S6e、f、i – l）、2つのサイドビームレットを外側にシフトすると、よりガウスに似たライトシートが得られます（図S6g、h、i – l）。

これらの変数は、以前の出版物がガウスビームと格子ライトシートの間の性能の違いを検出できなかった理由を説明できる可能性があります 12。我々は、これは適用された特定の定量化メトリクスによるもの、または比較のために選択された中心 NA、ΔNA、格子間隔の特定の組み合わせによるものである可能性があると仮説を立てています。あるいは、この矛盾は、問題の研究に使用された実験設定のニュアンスによって説明される可能性があります。境界エンベロープは、SLM 上のパターンをトリミングすることによって、または格子をもたらした可能性のある円柱レンズを介して上流の照明を制限することによって適用できます。非常にガウス的な性質を持つパターン。

ここで観察されたトレードオフを考慮して、MB 正方格子ビームと六方格子ビームの ΔNA が 0.1 のパターンをさらに調査することにしました。これらのパターンは、ビーム閉じ込めを過度に犠牲にせずに、軸方向の分解能の向上とビームの均一性の間の中間的な選択肢を提供します。ただし、どのパターンが最適であるかの選択はサンプルに依存することに注意してください。たとえば、クラスリンでコーティングされたピット、相分離した凝縮物、微小管などのまばらに分布した蛍光構造は、焦点が合っていない蛍光に過度に悩まされずに、閉じ込めの少ない光格子によってもたらされる軸方向の解像度の向上を利用できる可能性があります。対照的に、アクチン、細胞質 GFP、または核内の高密度クロマチンなどの高密度の蛍光サンプルでは、最大限に達成可能な軸方向の分解能が犠牲になる一方で、より限定された照明パターンの恩恵を受ける可能性があります。これらの特徴にわたるパターン間を調整できることは、格子ライトシート顕微鏡法の利点の 1 つです。

これらの各ビームに固有の軸方向の解像度、ビームの均一性、および光学的切断におけるトレードオフを考慮して、シミュレーション画像を使用してその性能をより完全に理解することに努めました。 3 エミッター/μm3 の初期密度で複数の点エミッターから構成される画像を生成し、ショットノイズ、エミッター強度、およびサンプルの自家蛍光の影響をモデル化しました (「方法」を参照)。 YZ 平面内のこれらの画像のスライスは、ビーム焦点と伝播軸の FWHM の両方で示されています (図 3a、b)。解像度を定量化するために、複数の独立した観測から得られた空間周波数間の相関を通じて解像度を測定する FPC を利用しました。これは、3D イメージングの解像度の異方性に対処できる点を除けば、フーリエリング相関 (FRC) に似ています。実際には、生の 3D シミュレーション画像に基づいて ky = 0 で FPC 平面を計算しました (図 3c、d)。これらの測定では、FPC が 1/713,15 のカットオフ値を超えた領域内のより大きな領域として、より高い解像度が測定されます。図3aに示すように、シミュレーションされた画像は、シングルビーズシミュレーションと同様の傾向を示しています。ガウスからMB正方格子、六方格子に至るまで、軸方向の解像度と全体の解像度が段階的に向上しています。カットオフ値を超える FPC の軸方向の広がりと総積分面積 (図 3c、e)。さらに、MB正方格子ビームと六方格子ビームの場合、伝播方向に沿った分解能の劣化はほとんどありませんが、ガウスビームの場合、劣化はより大きくなります（図3d、e）。予想通り、焦点の合っていない照明による背景も、ガウスビームから MB 正方格子ビーム、そして六方格子ビームへと徐々に増加しています。このバックグラウンドの増加のトレードオフとして、さまざまな種類のビームを使用するにつれて横方向の解像度がわずかに低下します。エミッタ密度を増加させた画像（10/μm3）（図S7）またはより高いバックグラウンド（信号対バックグラウンド比3）（図3f）を使用して画像をシミュレートすると、同様の傾向が観察されます。

a、b 各ビームタイプの焦点および伝播FWHMでの代表的な生のxzスライス画像。 c、d (a、b) の独立してシミュレートされた画像の 2 つのコピーに基づいて計算されたフーリエ平面相関 (FPC) 画像。 MB 正方格子と六方格子の FPC 画像については、1/7 のカットオフ範囲内のガウスに対する FPC 振幅の比率を示します。 e、f 伝播方向に沿ったさまざまな位置でのシミュレートされた画像の相対的な統合 FPC エリア。 f より低いシグナル対バックグラウンド比 (SBR = 3) で計算されることを除き、(e) と同じ。相対 FPC 面積は、1/7 より大きい値を持つ kx–kz FPC イメージの合計面積として計算され、伝播の中心のガウスの FPC 面積によって正規化されます。 g、h Richard-Lucy は (a、b) の画像を逆畳み込みました。

広視野顕微鏡と同様に、このバックグラウンドは、線形デコンボリューション (ウィーナーなど) または反復的デコンボリューション (リチャードソンルーシーなど) によって計算的に除去できます。デコンボリューションはまた、六方格子照明における非単調減少するOTFを平滑化し、励起パターンのサイドローブからの寄与を効果的に抑制します（RLデコンボリューションの場合は図3g、h、ウィナーデコンボリューションの場合は図S8）。これらの結果を総合すると、光学的セクショニングの減少にも関わらず、MB 方形および六方格子照明パターンで生成された画像は試料からより多くの情報を取得でき、結果として解像度が高く、より等方性の高い画像が得られることを示しています。ビームの均一性が向上したため、この解像度の向上は、ビーム伝播方向の FWHM で比較した場合や、焦点外の蛍光が計算的に除去され、デコンボリューションによって OTF 空間周波数が再重み付けされた場合にさらに明らかになります。ただし、MB 正方形および六方格子ライトシートは常に同じ長さのガウスビームよりも軸方向の解像度が高い一方で、MB 正方形および六角形格子ライトシートの全体的な解像度の向上は、シミュレーション内の信号対ノイズに依存していることに気付きました。画像。同じ信号対バックグラウンド比を維持しながら、100カウントのより低い強度（したがってより多くのショットノイズ）でエミッタをモデル化すると（図S9）、MB正方形および六角形格子ライトシートからの画像はより高い軸解像度を持ちました。ただし、ガウスビームと比較して積分FPC信号の増加はありませんでした（図S9g）。これは、S/N 比が低下すると、FPC 面積を計算する際に、MB 正方格子または六方格子の光学的分割が低下することによる横方向分解能の犠牲が、最終的には軸方向分解能の向上を上回る可能性があることを意味します。

シミュレーションから得られた結論が生体サンプルでも持続するかどうかを検証するために、次に、上記と同じビームを使用してさまざまな細胞内構造を画像化しました。私たちは、核、ミトコンドリア、およびアクチン細胞骨格のクロマチン、つまり細胞内の広範囲の形態と密度にわたる特徴を画像化することにしました。公平な比較を保証するために、「方法」で説明されているように蛍光ビーズのシグナルを測定することにより、各ビームがサンプルで等しいピーク強度を持つように強度を調整しました。図4では、生およびRLデコンボリューションされたYZ画像スライスを、アクチンフィラメント（図4a〜e）、クロマチン（図4f〜j）、およびミトコンドリア（図4f〜j）のズームイン領域およびラインカットプロファイルとともに示しています。 .4k–o) はビーム焦点を中心に配置されます。生の実験画像では、軸方向解像度とライトシート閉じ込めの間のトレードオフは依然として有効です。MB 正方格子ビームと六方格子ビームで撮影された画像は、より高いバックグラウンドを犠牲にして軸方向解像度が優れています (これらも次のように定量化できます)。図 S10a ～ c に示す FPC）。この背景に加えて、生の画像では、六角形格子ライトシート照明のマルチローブ構造も明らかになります。デコンボリューション後、バックグラウンドとサイドローブの両方が大幅に減少します (図 4c、h、m)。全体として、これらのデータセットはシミュレーション画像から引き出された結論と一致しており、さまざまな固定された生物学的サンプルにおいて異なるビーム間のトレードオフが持続することを示しています。

細胞内のアクチンフィラメント構造の 3D 概要。オレンジ色の輪郭は、(b、c) に使用される ROI スライスを示します。 b、c 3 つの異なるビームと融合 MB 正方形 + 六角形条件で取得された、Raw および RL デコンボリューションされた YZ スライス。シアンの境界ボックスを拡大して右側に示します。 d、e bの赤い破線に沿った各条件の画像強度プロファイル、相対強度プロットは任意単位（au）で表示されます。 f – o クロマチンとミトコンドリアの画像の（a – e）との比較可能なプロット。

生物学的サンプルの軸方向の解像度が高いにもかかわらず、高いバックグラウンドによる横方向の解像度の低下により、MB正方形および六方格子画像の統合FPC面積がガウス（図S10d）と比較して小さいことに気づきました（観察に似ています）図S9の低信号でのマルチビーズシミュレーション）。これらの観察は、取得された画像の強度にはほとんど依存しないことを示しています（4分の1の励起パワーで撮影された画像、したがってSNRが低い画像については図S11を参照）。これは、これらの2つのイメージング条件では、焦点が合っていない信号からのショットノイズが増加したことを示しています。横方向の解像度が損なわれます。

格子照明モードでの光学的セクショニングの低下による横方向解像度の損失に対処するために、ここでは、相補的な特性を持つ異なるライトシートを使用して標本の2つの連続照明からの画像を結合することを提案します。複数の角度から標本を観察する他のマルチビューフュージョンアプローチと同様に、適切に設計されたライトシートを用いたマルチライトシートフュージョンは、OTF 空間のディップを効果的に埋めることができます。これらの融合により、MB 方形および六方格子ライトシートの軸方向解像度の向上と伝播均一性が組み合わされ、下部光学セクショニングによるショットノイズの増加による解像度の低下が回避されます。私たちのアプローチでは、マルチビューフュージョンはデコンボリューションなしで行われ、MB正方格子と六方格子のOTF強度に基づいて加重和を計算することによって周波数空間で実行されます（詳細は方法で説明されています）。このアプローチは、各画像のスペクトル信号対ノイズを効果的に組み込んでおり、単一カメラ露光内での画像の直接加算や複数のライトシートのインコヒーレント加算よりも均一な OTF を実現します。図S12に示すように、MB正方形と六方格子画像のスペクトル重み付けされた融合により、OTF拡張を維持しながら六方格子のOTFのくぼみが埋められ、同等の軸方向FWHMを持つPSFが得られましたが、六方格子と比較してサイドローブが減少しましたここで使用したライトシート。固定された生物学的サンプルからの画像にマルチビューフュージョンを適用すると、六角形格子と同等の軸方向解像度が観察されましたが、バックグラウンドは減少し（図4）、FPCの全体的な増加につながりました（図S10a–d）。

しかし、より複雑な細胞構造をイメージングする際、場合によっては、六方格子照明で取得した画像に、軸方向解像度の単純な増加とは矛盾する予期しない空間構造が示されることが観察されました。一例を図S13に示します。ここでは、MB正方格子とガウスビームで撮影したデコンボリューション画像と比較して、原子核の底面がシフトして見えます。ウィーナー法と反復デコンボリューションの両方が、アーティファクトなしで六角形照明の焦点外の背景を効果的に抑制できることを、シミュレートされたデータセットと他の実験データセットの両方で示したので（図S14）、この不一致の原因を理解しようとしました。 1 つの仮説は、アーチファクトは、生体サンプルの厚い領域を通過するときにライトシートが逸れることによって引き起こされるような、検出焦点と励起焦点の間の位置ずれによるものであるというものです。私たちのシミュレーションデータは、このような位置ずれが実際にPSF全体の軸方向のシフトにつながる可能性があり、この位置ずれが特に深刻な場合にはマルチローブ構造アーチファクトを引き起こす可能性さえあることを示しています（図S15およびS16）。これが画像で発生する可能性があるかどうかをテストするために、細胞の下に蛍光ビーズを使用して、励起焦点面と検出焦点面の間の相対的なシフトを実験的に測定しました（図S17、測定の詳細は「方法」で説明されています）。核と細胞培養培地間の屈折により、細胞の底部で 500 nm もの大きな軸方向のずれが生じる可能性があります。この大きさのシフトは全体的な PSF を変化させ、再構成された画像にアーチファクトが生じる可能性があります。これらの測定は、サンプル誘起ライトシートオフセットが無視できる環境下、例えば薄いサンプル、光学的に透明なサンプル18、屈折率が一致した細胞培養培地19を使用する場合、またはこれらの収差を補正するために補償光学と組み合わせた場合10、六方格子光が存在することを示唆しています。シートを適用すると、サイドローブによるアーティファクトを発生させることなく、軸方向の解像度を向上させることができます。ただし、サンプルに起因するビームの位置ずれが大きくなることが予想される実験では注意が必要です。

最後に、内因性レベルで蛍光タグ付きタンパク質を発現するように CRISPR-Cas9 遺伝子編集された生きた IPSc 細胞を画像化し、3 つの異なるライトシートの光退色と光毒性の効果を定量化しました。比較のために、10 μm の軸方向エンベロープにわたって同じピーク強度または同じ積分強度を持つように、異なるライトシートの強度を調整しました。低強度（サンプルで〜0.033 μW/μm2、試料から〜60フォトンピーク）と高強度（サンプルで〜0.1 μW/μm2、試料から〜240フォトンピーク）の両方のイメージング条件をテストしました（詳細結果は図S18および表S3に示されています）。 α-チューブリン-GFPを発現する生IPSc細胞の3Dスタックを0.14 Hzの速度で700秒間繰り返しイメージングしました。図S19に示すように、テストした最高強度でも光退色は観察されましたが、顕著な光毒性は観察されませんでした。微小管の動態の変化を視覚的に検査することで評価される 3 種類のビームのいずれか。光退色を比較するために、タイムラプス内の各スタックのピクセル強度の合計を正規化し、これを時間に対してプロットし、この曲線を指数関数的減衰に当てはめました（図S20）。次に、減衰する指数成分をこのデータに当てはめて図5にプロットします。図に示すように、同じピーク強度でイメージングした場合、ガウスビームはMB正方格子や六方格子と比較して光退色が少なくなります（図5a、c）。 100 個の連続体積の測定では、ガウスビーム照明からの残留試料蛍光は 75% に低下しました。これに対し、MB 正方格子では 69%、六方格子では 62% でした。これは、軸方向の励起プロファイルの閉じ込めが厳しくなり、ガウス照明による総光量の減少によるものと考えられます（図 5a、c の右軸）。ほとんどの場合、同じ積分強度を有するライトシートは同様の光退色率を共有するため、光退色率は積分強度に大きく依存します（図5b）。ただし、これはサンプルと強度に依存しているようです。図5dに示すように、微小管が同じ積分強度のビームで照射されると、ガウスビームの光退色は大幅に速くなります。これは、おそらくMBスクエアと比較して瞬間ピーク強度が高いためです。および同じ総線量の六角形格子（図5dの右軸）。

a、b 3 つの異なるビームで画像化された、α-チューブリンで蛍光標識された iPSC 細胞を発現する iPSC 細胞の光退色指数関数的減衰定数。各条件ごとに 5 つのセルが取得されます。プロットには、中央値 (赤い線)、25 および 75% の分位数 (青いボックス)、データ範囲 (ひげ)、外れ値 (赤い十字) が表示されます。緑の点は第 2 の右軸にプロットされており、3 つのビームが同じ相対ピーク (または積分) 強度を共有する場合の MB 正方格子と比較した相対積分 (またはピーク) 強度を示します。 c、d 光退色比較は（a、b）と同様ですが、より高い照明強度で取得されました（（低SNRのサンプルで〜0.033μW/μm2対高SNRのサンプルで〜0.1μW/μm2）。

この論文では、ライトシート顕微鏡で使用されるさまざまなビームパターン間のトレードオフを特徴付けるために、シミュレーションと実験的測定の両方を実行しました。当社では、異なるエミッター密度と信号対雑音比でのシミュレーション画像と、生細胞と固定細胞の両方でさまざまな細胞内構造をイメージングする際の両方で、実空間の FWHM 比較、周波数空間の OTF 比較、および FPC を使用してビームの性能を評価します。重要なのは、これらの測定をビーム焦点だけでなく、ビーム伝播長に沿ったさまざまな点でも行うことです。すべての場合において、ガウスビームまたはフラットトップビームと比較した場合、MB正方格子および六方格子の伝播方向に沿った軸分解能とビーム均一性が明らかに向上していることを示しています。以前の相反する発見を解決するために、さまざまな格子パターンをよりガウスまたは格子に近づけることによって、さまざまな結像条件に合わせて最適化する方法について説明します。

これらの利点のトレードオフは、MB 正方形、六方格子、およびフラットトップビームの両方で、ガウスビームと比較して面外励起が増加し、光学的セクショニングが減少することです。蛍光濃度の高いサンプルでは、焦点が合っていない背景からショットノイズが増加し、横方向の解像度が低下し、生きている標本の光退色が増加します。これに対処するために、スペクトル融合ライトシート照明の方法を導入します。このアプローチは、同じ長さと相補的な光学特性を持つライトシートで撮影した 2 つの連続画像をスペクトル的に重み付けして加算することにより、低バックグラウンドの MB 正方格子照明と高軸解像度の六方格子照明の両方の利点を組み合わせます。

さまざまな細胞構造を画像化することで、光退色は複雑であり、総線量だけでなく、瞬間的な強度や細胞内の局所的な化学微小環境にも非線形に依存する可能性があることを実証しました。解像度と均一性が光退色よりも重要ではないアプリケーションの場合、または安定性の低い蛍光色素分子の使用が必要な場合、ガウスビームは、フラットトップ、MB 正方格子、または六方格子ビームと比較して、サンプルに供給される照明量が最も少なくなります。同じ伝播長と同じピーク強度の。あるいは、軸方向の分解能とビームの均一性が重要な場合は、特定の長さのビームに対して、MB 正方格子と六方格子、または両方の融合画像が試料からより高解像度の情報を取得し、分解できない特徴を分解します。ガウスビームで見える。実験の要件に応じて、これらの要素のバランスを取るために異なる格子ライトシートを選択できます。

この文書のすべての解像度比較、FWHM プロファイル、OTF 測定、および FPC は、デコンボリューションを行わずに生データから行われています。比較したすべてのライトシートについて、これらの画像は、線形（ウィーナーなど）または反復（リチャードソン・ルーシー（RL）など）デコンボリューションを介してさらに処理して、ライトシートプロファイルを含む機器の応答を補正し、より正確なデータを復元できます。真のサンプル構造を正確に推定します。線形デコンボリューションと反復デコンボリューションの両方が、テストされたすべてのライトシートの焦点外のぼやけを除去でき、正しい PSF モデルと使用すると、アーチファクトのない標本画像を正確に復元できることを実証します。ただし、定量的な解像度の比較にデコンボリューションされた画像を使用しないように強く警告します。多数のユーザー定義パラメータが復元されたイメージに影響を与える可能性があり、これらのパラメータを公平な方法で調整することは簡単ではありません。たとえば、RL デコンボリューションの反復回数を固定すると、条件間の不偏な比較が可能になると素朴に仮定するかもしれません。ただし、RLデコンボリューションは、ライトシートプロファイルが異なると異なる速度で収束することが観察されました（図S21a）。したがって、すべての条件にわたって一貫した量の収束が達成されるように、各画像の反復回数を変更することにしました。線形ウィーナーデコンボリューションの場合、ノイズ対信号比 (NSR) 正則化パラメータを一定に保つことを選択しましたが、これの最適値はサンプル構造、光子数、およびライトシートプロファイルの両方に依存する可能性があることに注意してください。これらの懸念のため、定量的な比較には生データのみを使用しました。これにより、格子ライトシート顕微鏡による解像度の向上を実現するためにデコンボリューションが必要ないことが実証されました。

一般的な注意として、解像度を特徴付けるために点エミッターの FWHM や主励起ローブの厚さをレポートするような実空間メトリクスのみを使用しないように注意してください。このような特性評価は、ガウスビームの場合は直感的ですが、より複雑なプロファイルの場合はしきい値またはカットオフの選択に大きく依存する可能性があります (図 S22)。私たちの意見では、解像度の完全な説明は、OTF または FPC などの生体サンプルの画像と互換性のある客観的な指標の両方を調査することによって、周波数空間で最もよく特徴付けられます。要約すると、この比較により、将来のユーザーが特定の生物学的用途に最適なライトシートを選択できるようになることを願っています。生物学的標本を画像化することは、微妙で困難な作業です。妥協のない実験観察ツールはありませんが、さまざまな照明プロファイルのトレードオフと利点について明確でバランスの取れた議論を行うことで、ユーザーは実験の目標に基づいて情報に基づいた決定を下すことができます。

まず励起対物レンズの後部瞳における複素電場を定義することにより、サンプルにおけるさまざまなライトシートの励起プロファイルをシミュレートします。ガウスライトシートとフラットトップライトシートの場合、この複雑な電場はフーリエ変換され、二乗されてサンプル焦点における強度プロファイルがシミュレートされます。 MB正方格子と六方格子のビーム形成の実験プロセスをよりよく近似するために、後部瞳上の理想的な複素電場をフーリエ変換してサンプル焦点における理想的な電場をシミュレートする中間ステップを導入しました。次に、この理想場の実数成分のみを取得して、これらのビームを実験的に生成するために使用される空間光変調器（SLM）の効果をシミュレートします（図S23a）。試料における理想的な電場位相プロファイルはゼロまたはパイであるため、このアプローチは、バイナリ SLM を使用する場合でもグレースケール SLM を使用する場合でも、反射波面の位相を操作し、格子パターンを実験的に生成する場合に有効です。次に、このSLM画像は逆フーリエ変換され（図S23b）、望ましい内側と外側のNAの組み合わせを持つ環状マスクによってフィルタリングされて、DC成分をブロックし、1次の回折次数を選択的に通過させます（図S23c、d）。最後に、このフィルタリングされた複素電場は最後にフーリエ変換され、サンプル焦点での強度プロファイルをシミュレートするために二乗されます（図S23f）。これらのステップは、ライトシートが SLM で反射し、瞳共役面でマスクによってフィルタリングされる格子ライトシート顕微鏡の光路をシミュレートするためのものです。ガウスライトシートのシミュレーションでは、SLM とマスクを通過しないため、このようなステップはバイパスされます。サンプルでのビーム伝播長に沿ったさまざまな位置での励起プロファイルをシミュレートするには、複雑なデフォーカス位相プロファイル \({{{{{\rm{exp}}}}}}(2\pi{i}{k }_{y}\times{y})\) を Hanser らの方法に従ってフーリエ変換する前の瞳フィールドに変換します。ここで、y はビーム焦点からの距離を示し、\({k}_{y }=\sqrt{1-({{k}_{x}}^{2}+{{k}_{z}}^{2})}\)、瞳孔における波動ベクトルの投影です。ビーム伝播方向に沿って20。

原点を中心とし、瞳面内の線 kx = 0 に沿って広がるガウス振幅プロファイルを持つ実数値の電場によってガウスビームを定義します。ガウスライトシートの開口数 (NA) を、瞳の振幅が中央のガウスピークの 1/e に低下する値として定義します。後部瞳の電場は \({E}= のプロファイルに従います) {E}_{0}\time {{{{{\rm{exp }}}}}}(-{(\frac{{k}_{z}}{{{{{{{\rm{NA }}}}}}}})}^{2})\)。同様の方法でフラットトップビームを、後部瞳でのカットオフNAを持つ線kx = 0に沿った一定振幅の実数値電場として定義します（図S24a）。正方格子ライトシートは、サンプル面で定義された x 軸間隔を持つベッセルガウスビームのコヒーレントアレイの干渉パターンとして、または後瞳の特定の NA を中心とする 4 つのビームレットのコヒーレント干渉パターンとして生成できます。そして、線kx = 0に対して0、90、180、および270度に配置されます（図S24b）。これまでの研究では、MB 正方格子が、各ビームレットが kz 方向に沿って一定の強度プロファイルを持つ、考えられる正方格子ライトシートのサブセットと同等であることが実証されています2。この作業では、最初に環状マスクの \(\Delta {{{{{{\rm{NA}}}}}}}\) を定義することで、MB 正方格子をシミュレートしました。次に、4 つの実数値ビームレットが後部瞳孔内に生成されました。 0 度および 180 度のビームレットは横方向の中心が線 kx = 0 にあり、90 度および 270 度のビームレットは軸方向の中心が線 kz = 0 にありました。90 度および 270 度のビームレットの kx 位置はサンプルによって決定されます。コヒーレントベッセルビームの面間隔、または瞳面に直接設定できます。特に記載のない限り、以前に行ったように 2、90 度および 270 度のビームレットの kx 位置をマスクの内側環状体のすぐ外側に設定します。次に、4 つのビームレットのそれぞれが、環状マスクのカットオフによってトリミングされた一定の実数値の振幅を持つように、kz 方向に沿って拡張されました。この特定の構成では、定数 \({\varDelta k}_{y}=\sqrt{\left(1-{{{{{{\rm{NA}}}}}}}_{{{\min) }}}}^{2}\right)}-\sqrt{\left(1-{{{{{{{\rm{NA}}}}}}}_{{{\max }}}}^ {2}\right)}\) は、4 つのビームレットすべての間の湾曲した瞳表面上にあります。この条件では、サンプルをフーリエ変換した後、4 つのビームレットすべてが寄与する電場はサンプルでの伝播長が等しくなり、最も伝播不変のビームが得られます。六方格子は、6 つのビームレットを \({{{{{\rm{NA}}}}}=\frac{{{{{{{\rm{NA}}}}}}}_{{ {\max }}}+{{{{{{\rm{NA}}}}}}}_{{{\min }}}}{2}\)、NAmax と NAmin は外側と内側の NA瞳孔面で。瞳孔内の各スポットの電場は、 \(E=\,{E}_{0}\times {{{{{\rm{exp }}}}}}(-{ (\frac{{k}_{z}}{\triangle {k}_{z}})}^{2})\)。ここで \({\triangle k}_{z}={{{{{\rm{FC}}}}}}\cdot \left({{{{{{\rm{NA}}}}}} _{{{\max }}}-{{{{{{\rm{NA}}}}}}}_{{{\min }}}\right)\)、FC はフィルファクターです。シミュレーションでは 1 に設定されました (図 S24c)。実験的なディザリングをシミュレートしてサンプルで均一な照明プロファイルを生成するには、サンプルでの強度プロファイルを x 方向に沿って平均して、最終的な励起 PSF を生成します。 NA = 1.0、インデックス 1.3321 の Richards と Wolf の環状場積分に従って検出 PSF がシミュレートされ、全体の PSF が励起 PSF と検出 PSF のピクセル単位の積として計算されます。全体的な OTF は、全体的な PSF のフーリエ変換です。

シミュレートされた PSF の特性を評価するために、PSF 全体の全幅半値 (FWHM)、OTF サポート範囲、光学セクショニングを計算しました (表 S2)。全体的な PSF の軸方向プロファイルに基づいて、MATLAB (Mathworks) の「findpeaks」関数を使用して照明の FWHM を計算します。この関数は、ピークプロミネンスを使用して最大半値を定義します。ここで使用される軸対称パターンの場合、最大半値は、中心ピークと±10λ以内の最小照度値の間の値の50％として定義されます（図S22）。 OTF サポート範囲は、OTF 振幅が DC 値の 0.1% に低下する周波数範囲として計算され、光学セクショニングは累積強度の 63% が収まる半値幅に基づいて計算されます (Remacha et al. と同じ)。 11)。私たちの特徴付けを以前に発表された結果と比較するために、Remacha らの結果にも従いました。そして、励起プロファイルのメインローブ幅、光学的セクショニング、および光学的セクショニングに基づいた伝播長を計算しました。ただし、この場合、メインローブの幅を、強度がピークの 63% に低下する幅として定義しました。これは Remacha らで使用されているしきい値とは異なることに注意してください。 (37%)。 37％のしきい値を使用すると、MB正方格子と六方格子の場合、励起のサイドローブにより、プロットで中心軸ピークの幅が大幅に過大評価されることがわかりました（図S22）。一般に、この不一致は、非ガウスビームを定義するために単一のパラメーター (カットオフ強度など) を使用することの課題を示しています。そのため、伝播長に沿った各ビームの OTF を比較するなど、より客観的なメトリクスを使用することが好まれます。最後に、ここで使用したように強度 FWHM を使用して定義されたビーム伝播長と、Remacha et al のように光学的切断が 2 倍になる距離を使用して定義されたビーム伝播長も比較します。そして、これらがビーム長の非常に類似した推定値を提供することを示しています（表S1）。

以下のように、蛍光ビーズの 3D ボリュームのイメージング条件をシミュレートしました。定義された密度でランダムに分布した点の 3D ボリュームが最初にグラウンドトゥルース画像として生成され、次にさまざまなライトシートからシミュレートされた全体 (検出 + 励起) PSF と畳み込まれます。特定の画像に対して、伝播方向に沿った PSF の変動を考慮せずに、単一の全体的な PSF を使用して 3D ボリューム全体を畳み込みます。したがって、ビーム伝播の中心でのシミュレートされた画像については、ビーム中心での全体の PSF が使用され、同様に、ビーム伝播の FWHM でのシミュレートされた画像についても使用されます。自己蛍光をシミュレートするために、PSF 畳み込みの前に、一定のガウスノイズフロアがグラウンドトゥルース画像に追加されます。ショットノイズを正確にモデル化するために、独立したポアソンノイズが、畳み込み前の PSF と畳み込み後のシミュレートされた画像の両方の各ピクセルに追加されます。シミュレートされた画像に偽の相関が導入されるのを避けるために、ポアソンノイズは画像と PSF のペアごとに個別にサンプリングされます。軸方向および横方向の解像度を定量化するために、Nieuwenhuizen et al.13 で説明されているように、同じグランドトゥルースと PSF でそれぞれ独立したポアソンノイズを使用して生成された 2 つのシミュレート 3D 画像に FPC を採用しました。 FPC グラフでは、各ピクセルを原点に接続するベクトルがフーリエ空間の平面を定義し、その平面上で 2 つの画像間の相関係数がそのピクセルの強度に割り当てられます。 kx = 0 および ky = 0 で FPC 平面を平均し、画像全体の解像度の定量化として FPC 値が 1/7 より大きい領域を計算しました。

蛍光ビーズをイメージングし、リン酸緩衝生理食塩水 (Corning、商品番号 46013CM) 中で細胞を室温で固定しました。 Flurobrite (Thermo Fisher、A1896701) + ウシ胎児血清 (FBS、VWR: 1500-050) + ペニシリン - ストレプトマイシン (Gibco 15140-122) を使用し、5% CO2、37 °C で生細胞を画像化しました。すべての測定値は、Chen et al.2 で説明されている機器の修正バージョンで取得されました。この研究に関連する主な修正は、グレースケール SLM (Meadowlark P1920-0635-HDMI)、NA 0.6 励起レンズ (Thorlabs、TL20X-) の使用です。 MPL）、および 1.0 NA 検出レンズ（Zeiss、対物レンズ W「プランアポクロマート」× 20/1.0、モデル番号 421452-9800）（図 1a）。バランスの取れた比較を行うために、直径 100 nm の単一の赤色蛍光ビーズ (580 nm/605 nm 励起/発光波長、Thermo Fisher、F8801）。特に明記しない限り、すべてのライトシートはサンプルで同じピーク強度を持つように調整されました。これを達成するために、各ライトシート位置でビーズからの積分発光をプロットすることによって相対的なライトシート強度を測定し、次に、同じピーク強度または同じ積分強度を達成するように音響光学調整可能フィルターの設定を調整しました（注記がある場合）。）異なるライトシートごとに。異なるライトシートのそれぞれについてサンプルでの平均パワーを推定するために、励起対物レンズの入力瞳で測定された合計パワーを、ライトシートの幅 (w) と各ビームの軸高さによって決定される面積で割りました。 % のビームエネルギーが含まれていました (h90) (図 S18 および表 S3)。ステップサイズ 200 nm (検出対物レンズの軸方向に沿って各ステップで 107 nm、サンプルステージの動きと検出対物レンズの間に 57.6 度の角度があることを考慮すると、ライトシートを通してサンプルステージを横方向にスキャンすることにより、生体サンプルをイメージングしました)。検出対物レンズの光軸、または同等に、検出対物レンズの結像面とサンプルステージの動きの間の 32.4 度の角度)。 FPC 解析では、ステージを移動する前に、各位置で 20 ミリ秒の露光で 2 つの画像を取得しました。次に、同じ関心領域が、それぞれ異なる種類のライトシートを使用して連続的に画像化されました。

シミュレーション画像と生物学的画像の両方について、各ライトシートについて実験的に測定された対応する全体的な PSF を使用して、Richard-Lucy デコンボリューションを適用しました。実験的に取得された生の画像スタックは、検出座標とサンプルの座標の間の角度により歪んでいるため、生の実験画像は、カメラの暗電流の平均値を使用して背景が差し引かれる前に、まず傾きが補正されます。暗電流の減算後、負のピクセルはゼロにクリップされ、組み込みの Matlab (Mathworks) 関数「deconvlucy」を使用して、デスキューされた画像に RL デコンボリューションが適用されます。さまざまなライトシートパターンの収束速度の違いを補償し（図S21a）、OTFサポートを超えて外挿することで画像内のノイズが増大するのを避けるために（図S21b）、ピクセル単位の二乗平均平方根が得られるまでRLデコンボリューションを繰り返し適用しました。隣接する反復間の差が最初の反復の 25% を下回ります。したがって、異なるライトシートの画像をデコンボリューションするときに異なる反復回数を使用しましたが、各最終条件が同じ程度の収束に達することを確認しました。ウィーナーデコンボリューションでは、すべての条件に対して NSR 0.005 の Matlab 組み込み関数「deconvwnr」を適用しました。

我々は、安定して組み込まれたヒストン H2B-HaloTag プラスミド 22 (Janelia Research Campus の Tim Brown から贈呈、RRID:CVCL_0224) を発現する COS7 細胞を、10% FBS (VWR: 1500-050) を含むダルベッコ改変イーグル培地 (Gibco 11965-092) で培養しました。 1% (v/v) 10,000 U/ml ペニシリン-ストレプトマイシン (Gibco 15140-122)。 Allen Cell Collection Cell Lines (モノ対立遺伝子 mEGFP タグ付き TUBA、AICS-0012) から iPSC 細胞 (Coriell Institute for Medical Research から購入、RRID:CVCL_IR34) を取得し、5 倍のサプリメントを含む基礎培地で培養しました。 4:1 (STEMCELL Technologies 85850_c) と 1% (v/v) 5000 U/ml ペニシリン/ストレプトマイシン (Gibco 15070-063) の比率。固定細胞イメージングでは、ミトコンドリア染色用の培地中の 250 nM mitotracker orange (Thermo Fisher、M7510) またはヒストン染色用の培地中の 250 nM JF549 のいずれかと COS7 を 30 分間インキュベートしました。次に細胞を細胞骨格緩衝液（10 mM MES、138 mM KCl、3 mM MgCl、2 mM EGTAで構成）中で4%パラホルムアルデヒド（Electron Microscopy Sciences、15710）および8 nM/mlスクロース（Sigma、S7903）で20分間固定しました。室温で1分。アクチン染色では、細胞を 0.2% Triton-X (VWR Life Science、0694) で 10 分間透過処理し、その後 2% ウシ血清アルブミン (Sigma、A9418) および 0.1% Triton-X で 10 分間ブロックしてから、ファロイジンで染色しました。 555 (サーモフィッシャー、A34055) で 20 分間。

異なるライトシートからの画像の多視点融合は、周波数空間で実行されます。まず、MB 正方格子および六方格子ライトシートで撮影した実空間画像を周波数空間にフーリエ変換し、DC での振幅によって正規化しました。次に、周波数空間の多視点融合画像が、各パターンの相対的な OTF 強度によって決定される重みを使用した重み付き合計として計算されます: \({\widetilde{I}}_{{{{{{\rm{fusion}} }}}}}=\,{\widetilde{I}}_{{{{{{\rm{hex}}}}}}}\frac{{O}_{{{{{{\rm{hex }}}}}}}}{{O}_{{{{{{\rm{hex}}}}}}}+{O}_{{{{{{\rm{MB}}}}} }}}+{\widetilde{I}}_{{{{{{\rm{MB}}}}}}}\frac{{O}_{{{{{{\rm{MB}}}} }}}}{{O}_{{{{{{\rm{hex}}}}}}}+{O}_{{{{{{\rm{MB}}}}}}}\ )、ここで \(\widetilde{I}\) は画像のフーリエ変換を示し、O は OTF を示します。 \({\widetilde{I}}_{{{{{{\rm{fusion}}}}}}\) は、逆フーリエ変換されて実空間に戻され、多視点融合画像が生成されます。この周波数重み付け画像融合により、さまざまなライトシートパターンからの各周波数成分で信号とノイズのバランスが良くなり、単純な画像加算よりも滑らかな最終的な OTF が得られることがわかりました。

生体サンプルを通したイメージング時にライトシートが偏向する程度を測定するために、直径 100 nm の赤色蛍光ビーズでプレコートしたカバーガラス上で COS7 細胞を培養し、固定して Alexa 488 ファロイジンで染色しました。サンプルの下のライトシートのオフセットを測定するために、特定のステージ位置で、まず検出焦点面に対して励起プロファイルを軸方向にスキャンし、フィールド内の各ビーズの周囲の小さな（3ピクセル）領域からの積分された蛍光信号をプロットしました。ビュー。このプロットのピークは、サンプルの下の各ビーズの位置に対する励起プロファイルの中心を定義します。次に、検出対物レンズの光軸に沿ってライトシート照明とともにカバースリップを走査することにより、検出対物レンズの焦点面に対する各ビーズの位置を決定しました（広視野照明と同等）。次に、検出対物焦点面に対する励起パターンのオフセットは、ビーズに対するライトシートの位置と焦点面に対するビーズの位置を比較することによって、これらのプロットから計算されます。

サンプルサイズを事前に決定するために統計的手法は使用されませんでした。固定セルデータセットのビームタイプを比較するために、各試行で 3 つのセルを使用して実験を 2 回繰り返しました。単一細胞の代表的な画像を示します。すべてのセルに同じ傾向が表示されます。生細胞の光退色および光毒性試験のために、1 回の試験から 5 つの細胞を収集しました。トライアル内のすべてのセルは同じ傾向を示します。集計されたデータは図 5 にプロットされています。分析から除外されたデータはありません。実験はランダム化されていませんでした。研究者らは、実験と結果の評価中に割り当てについて知らされていませんでした。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

図の基礎となるデータセットは次のとおりです。 1 ～ 3 は、以下で説明するように入手可能なソースコードから再生成できます。サイズの制限により、図の基礎となるデータセットは次のとおりです。図 4 および 5 とすべての補足図 (ソースコードから生成できるものを除く) は、要求に応じて対応する著者から自由に入手できます。可能な限り、作成者は最初のリクエストから 2 週間以内にデータ共有のすべてのリクエストに応えるよう努めます。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

現在の調査中に生成されたソースコード、および/または現在の調査中に分析されたソースコードは、https://github.com/legantlab/Shi_et_al_Nat_Comm_SourceCode で入手できます。コードは、オープンソースイニシアチブによって承認された寛容なライセンスである、オープンソースソフトウェアの MIT ライセンスに基づいて提供されます。特定の条件については、https://opensource.org/licenses/MIT を参照してください。

レガント、WR 他大容量にわたる高密度の三次元局在化顕微鏡検査。ナット。方法 13、359–365 (2016)。

記事 Google Scholar

チェン、B.-C. 他。格子ライトシート顕微鏡法: 高い時空間分解能で分子から胚までをイメージングします。サイエンス 346、1257998 (2014)。

記事 Google Scholar

Sapoznik、E. et al. 細胞内ダイナミクスの大規模かつ高解像度イメージングのための多用途斜平面顕微鏡です。 eLife 9 https://doi.org/10.7554/eLife.57681 (2020)。

ケラー、PJ et al. 走査型ライトシート顕微鏡によるゼブラフィッシュの初期胚発生の再構成。サイエンス 322、1065–1069 (2008)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Lazzari、G. et al. ライトシート蛍光顕微鏡と共焦点顕微鏡：多細胞腫瘍スフェロイドへの薬物およびナノ医薬品の浸透を評価するための適切なツールを求めています。ユーロ。Ｊ．Ｐｈａｒｍ．バイオ医薬品。 142、195–203 (2019)。

記事 CAS Google Scholar

Planchon, TA et al. ベッセルビーム平面照明を使用した生細胞の高速三次元等方性イメージング。 Nat Methods 8、417–423 (2011)。

Fahrbach, FO、Simon, P.、Rohrbach A. 自己再構成ビームを備えた顕微鏡。ナット。フォトニクス 4、780–785 (2010)。

Vettenburg, T. et al. エアリービームを使用したライトシート顕微鏡法。 Nat Methods 11、541–544 (2014)。

ヤン、Z.ら。傾斜シリンドリカルレンズを搭載したコンパクトなエアリービームライトシート顕微鏡。バイオメッド。オプション。 Express 5、3434 ～ 3442 (2014)。

リュー、T.-L. 他。細胞をネイティブな状態で観察: 多細胞生物の細胞内ダイナミクスをイメージングします。サイエンス 360、eaaq1392 (2018)。

Remacha、E. et al. ライトシート顕微鏡における軸方向分解能を定義および最適化する方法: シミュレーションベースのアプローチ。バイオメッド。オプション。 Express 11、8 ～ 26 (2020)。

チャン、B.-J. 他。格子ライトシートとガウスライトシートの系統的かつ定量的な比較。オプション。エクスプレス 28、27052 ～ 27077 (2020)。

Nieuwenhuizen、RPJ et al. 光学ナノスコープにおける画像解像度の測定。ナット。方法 10、557–562 (2013)。

記事 CAS Google Scholar

Meschede, D. 光学、光、レーザー: フォトニクスとレーザー物理学の現代的側面への実践的アプローチ (WILEY-VCH、2007)。

Unser, M.、Trus, BL & Steven, AC スペクトル信号対雑音比に基づく新しい解像度基準。超顕微鏡法、23、39–51 (1987)。

記事 CAS Google Scholar

ウー、Ｙら。デュアルビュー平面照明顕微鏡による空間等方性の 4 次元イメージング。ナット。バイオテクノロジー。 31、1032–1038 (2013)。

記事 CAS Google Scholar

トーマー、R. et al. 同時多視点ライトシート顕微鏡による、発育中の胚全体の定量的高速イメージング。ナット。メソッド 9、755–763 (2012)。

Gao、R.ら。分子コントラストとナノスケール解像度による皮質柱および脳全体のイメージング。サイエンス 363、eaau8302 (2019)。

ブース、T.ら。細胞、組織、モデル生物のライブイメージング用の調整可能な屈折率整合媒体です。 eLife 6、e27240 (2017)。

ハンザー、BM 他。高開口数光学システムの位相回復。オプション。レット。 28、801–803 (2003)。

Richard, B. & Wolf, E. 光学システムにおける電磁回折、II。アプラナティックシステムにおけるイメージフィールドの構造。手順 R. Soc. ロンド。 A 253、358–379 (1959)。

記事 ADS Google Scholar

グリム、JB et al. 生細胞および生体内イメージング用に蛍光色素を微調整する一般的な方法。ナット。方法 14、987–994 (2017)。

リファレンスをダウンロードする

有益な議論と光学シミュレーションに使用されるコードの一部を提供してくださった Eric Betzig 博士に感謝します。また、この研究で格子ライトシート顕微鏡を実行するための制御ソフトウェアの支援をしていただいたダニエル・ミルキー博士にも感謝します。この研究の資金の一部は、WRLWRL に与えられた国立衛生研究所からの助成金 (1DP2GM136653) によって賄われ、サール奨学生プログラム、ベックマン若手研究者プログラム、およびパッカード科学工学フェローシップからの追加支援を認めています。

ノースカロライナ大学チャペルヒル校共同生体医工学部、ノースカロライナ州立大学、チャペルヒル、ノースカロライナ州、27599、米国

ヨウ・シー & ウェスリー・R・レガント

ノースカロライナ大学チャペルヒル薬学部、チャペルヒル、ノースカロライナ州、27599、米国

ティモシー A. ダギルド & ウェスリー R. レガント

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

YS と WRL はこのプロジェクトを発案し、研究を設計しました。 YS はシミュレーション、実験測定、データ分析を実行しました。 YS と TAD は実験測定に使用するサンプルを準備しました。 YS と WRL は、すべての著者からのフィードバックをもとに原稿を書きました。 WRL がプロジェクトを監督し、監督しました。

ウェスリー・R・レガントへの通信。

WRL は、格子ライトシート顕微鏡法とその応用に関連する特許の著者です。米国特許番号: US 11,221,476 B2 および US 10,795,144 B2 は、WRL および共著者に発行され、Howard Hughes Medical Institute に譲渡されています。 YS と TAD は競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

オープンアクセスこの記事はクリエイティブコモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブコモンズライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Shi, Y.、Daugird, TA & Legant, WR 格子ライトシート顕微鏡法に適用されるさまざまなパターンの定量分析。 Nat Commun 13、4607 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-32341-w

引用をダウンロード

受信日: 2022 年 5 月 18 日

受理日: 2022 年 7 月 26 日

公開日: 2022 年 8 月 8 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32341-w

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供

コメントを送信すると、利用規約とコミュニティガイドラインに従うことに同意したことになります。虐待的なもの、または当社の規約やガイドラインに準拠していないものを見つけた場合は、不適切としてフラグを立ててください。