サルのFoamy Virus受容体結合ドメインの結晶構造は宿主細胞への侵入に関する手がかりを提供する

Nature Communications volume 14、記事番号: 1262 (2023) この記事を引用

1843 アクセス

15 オルトメトリック

メトリクスの詳細

すべてのレトロウイルスの表面エンベロープ糖タンパク質 (Env) は、ウイルスの細胞への結合、およびウイルス膜と細胞膜の融合を媒介します。 オルソレトロウイルスサブファミリーに属する HIV Env の構造と機能の関係は十分に確立されています。 しかし、2 番目のレトロウイルス サブファミリーである Foamy ウイルス (FV) の Env については、構造情報がほとんど欠落しています。 この研究では、サル FV Env の受容体結合ドメイン (RBD) の X 線構造を 2.57 Å の解像度で提示し、2 つのサブドメインと前例のない折り畳みを明らかにしました。 我々は、三量体Env内のRBDの組織化モデルを生成しました。これは、上部サブドメインがEnvの頂点で籠状構造を形成していることを示し、下部サブドメインの残基K342、R343、R359およびR369を次のように同定しました。 RBD およびウイルス粒子とヘパラン硫酸との相互作用の主要な役割を果たします。

泡状ウイルス (FV) としても知られるスプマレトロウイルスは、4 億年以上にわたって脊椎動物宿主と共進化してきた古代のレトロウイルスです 1,2。 FV はヒト以外の霊長類に蔓延しており、ほとんどの場合、咬傷によってヒトに感染する可能性があります 3。 よく研究されているオルソレトロウイルス科の近縁種（HIV が最も注目すべきメンバー）とは異なり、FV はゲノムの変異が非常にゆっくりで、宿主ゲノムに組み込まれて生涯にわたる持続感染を確立するにもかかわらず、重篤な病態を引き起こしません 4,5。 これらの特徴は、幅広い指向性と宿主範囲 6 とともに、FV を遺伝子治療用の魅力的なベクター候補にしています 7。

ウイルス融合タンパク質は、エンドソームコンパートメントの酸性化および/または特定の細胞受容体への結合によって引き起こされる立体構造変化を通じて膜融合を推進します8、9。 FV はエンドサイトーシスによって細胞に侵入し、pH 感受性の方法でエンドソーム区画内でウイルス膜と細胞膜の融合が起こり、サイトゾルへのヌクレオカプシドの放出が引き起こされます 10。 例外はプロトタイプ FV (PFV) で、これも細胞膜で融合できます 11。 FV エンベロープ (Env) 糖タンパク質はクラス I 融合原に属し 12、三量体に折りたたまれる単鎖前駆体として合成され、その後細胞表面への輸送中にゴルジ コンパートメントでプロトマーが切断されます。 FV Env は成熟中に細胞フリンによって 2 つの部位で切断され、リーダーペプチド (LP)、受容体結合ドメイン (RBD) を含む表面 (SU) サブユニット、および膜貫通サブユニット (TM) の 3 つの断片が生じます。 ）、核融合機械を収容します。 FV Env で利用可能な構造情報は、ウイルス粒子のクライオ電子断層撮影 (ET) と PFV Env13 の 9 Å クライオ電子顕微鏡 (EM) 再構成に限定されており、これにより、LP-SU-TM 三量体がかみ合った六角形集合体に配置されていることが明らかになりました 13。 14、HIV Env 三量体とは異なるアーキテクチャを備えています15。

ヘパラン硫酸 (HS) は、PFV およびネコ FV16、17 の付着因子ですが、FV Env による膜融合を引き起こす表面受容体または細胞内受容体の要件は不明のままです。 受容体の探索は、細胞上に遍在的に発現するHSにFVが結合することで複雑化しており、潜在的な侵入受容体候補を覆い隠している。 ポリペプチド鎖の 2 つの不連続領域からなる二部 RBD は、細胞への結合に関して組換え SU 切断のパネルをスクリーニングすることによって同定されました 18。 RBD は、感染したヒトにおける中和抗体の主な標的であることも示されています 19,20。

FV Env は高度にグリコシル化されており、少なくとも 13 個の N 結合グリコシル化部位が予測されています。 変異解析により、これらの N 部位のうち 3 つが PFV の感染力に不可欠であることが明らかになりました。2 つは TM サブユニットに、1 つは RBD にあります。 グリコシル化部位 8 または N821 と呼ばれる後者の部位は、FV サブファミリー全体で保存されており、受容体への結合に直接的な役割を果たすことが示唆されています 18 (予測される N 結合型グリコシル化部位 (N1 から N821 まで) の命名法を区別するため) N15) アスパラギンの一文字記号 (N) から、前者には本文全体で下線が引かれます)。 RBD と宿主細胞との相互作用の残りの分子決定因子は、主に構造情報の欠如によりとらえどころのないままであり、変異誘発や機能解析への合理的なアプローチが妨げられています。 FV RBD の高解像度構造、Env 三量体内の RBD 組織に関する構造情報、および RBD が Env 活性化にどのように寄与するかは入手できません。

この原稿では、人獣共通感染症ゴリラ FV の RBD の X 線構造を 2.57 Å の解像度で提示し、新たな折り畳みを明らかにします。 PFV Env 三量体の利用可能なクライオ ET 再構成に剛体をドッキングすることによって 13、我々は Env における RBD 組織化のモデルを導き出し、機能的および進化的意味合いを議論しながら HS 結合に関与する残基を同定しました。 FV RBD の構造知識は、Env が膜融合を媒介する最初のステップであるウイルスと細胞の相互作用を理解し、ヒト宿主による抗体媒介の中和を洞察するために重要です。 我々のデータは、宿主細胞へのFV侵入のさまざまな段階の分子基盤を識別するために必要な、合理的な構造誘導突然変異誘発研究の枠組みを提供します。

いくつかのサル FV (SFV) 株からの組換え RBD をショウジョウバエ S2 昆虫細胞での産生についてテストしたところ、ゴリラ SFV (SFVggo_huBAK7422 株、遺伝子型 II、本明細書では「GII」と略す) からの RBD のみが十分な高収率で発現され、結晶が形成されました。 。 RBD は、8 つの予測された N-グリコシル化部位により、高度にグリコシル化されていることが予想されました (図 1a)。 十分に回折する結晶が生成される可能性を高めるために、「方法」セクションで説明したように、精製タンパク質の一部をエンドグリコシダーゼ H および D で酵素的に脱グリコシル化 (RBDD) しました。 RBDD および未処理タンパク質 (RBDG) の結晶が得られました。 RBDD は RBDG (2.80 Å) よりも良好に回折し (2.57 Å)、以下に示す構造解析は、特に断りのない限り、RBDD 構造を使用して実行されました。 両方の結晶形のデータ収集と構造決定の統計を表 S1 にまとめます。

a SFV Env タンパク質構成の概略図。リーダーペプチド (LP)、表面サブユニット (SU)、膜貫通サブユニット (TM) の 3 つの構成鎖を示します。 LP と TM を膜に固定する膜貫通ドメインはブラック ボックスとして表されます。 SU 内の受容体結合ドメイン (RBD) は青と赤のスペクトルで強調表示されます。 TM の N 末端の融合ペプチドは青色で示されています。 LP と SU (RIAR126)、および SU と TM (RRKR570) の間のフリン部位は、ハサミのアイコンで示されています。 RBD発現構築物は、N末端に外因性BiPシグナル、SFVゴリラGII Envの残基218〜552、およびC末端に二重strepタグ(2つの丸で示す)を含んでいた。 残基 420 ～ 426 を含む領域は、電子密度マップでは見られなかったため、破線で描かれています。 ゴリラ SFV Env の 17 の推定 N-グリコシル化部位は、以前に確立された命名法に従って星印で示され、N1 から N15 とラベル付けされています 22。 b RBDDのX線構造は、N末端からC末端までそれぞれ青から赤のスペクトルで色分けされたリボンモデルで示されています。 破線は、上位サブドメインと下位サブドメイン間の分離を示します。 N-グリコシル化部位は N で示され、糖とそれを運ぶアスパラギン側鎖は棒で表示されます。 図は Pymol65 で作成されました。 c RBD の線形表現。 電子密度に糖が組み込まれた 8 つの N-グリコシル化部位が灰色の星印で示されています。これには、RBDD ではなく、RBDG (分子 B) の結合炭水化物の密度を示した部位 N10 (N411) が含まれます。 部分的に埋もれた長い糖部分を含む部位 N8 (N390) は、太い輪郭で強調表示されています。 6 つのジスルフィドの位置は、パネル b のように番号付きの黄色の丸で示されています。 この図は BioRender.com で作成されました。

SFV RBD は 2 つのサブドメインに折りたたまれ、それぞれが α + β トポロジーを持ち、これを「下位」サブドメイン (残基 218 ～ 245、311 ～ 369、および 491 ～ 524) および「上位」サブドメイン (残基 246 ～ 310 および 370) と呼びます。 –490)、ウイルス膜に対するそれらの位置に関するもの13 (以下を参照)。 RBD は二葉の豆のような形状をしており、最長寸法は約 65 Å です。 上部サブドメインはより幅広（直径約45Å）を形成し、N末端とC末端は狭いローブ（直径約20Å）を形成し、これは下部サブドメインとも呼ばれます（図1b）。 下部サブドメインは、逆平行のねじれた 4 本鎖 β シート (β14-β1-β5-β15) およびヘリックス α2 (残基 333 ～ 346) に対してパッキングする 3 つのヘリックス束 (α1、α7、α8) で構成されています。それは束の側面に垂直に置かれます。 ヘリックス束とβシート内では、N 末端と C 末端に近い領域が、それぞれジスルフィド結合 (DS) DS1 (C228 ～ C503) と DS2 (C235 ～ C318) によって結合されています。 上部のサブドメインは、下部のサブドメインからの 2 つの長いエクスカーションによって形成されます。鎖 β1 と β5 を接続する約 70 残基と、η4 と β14 を接続する約 130 残基です (図 2)。 したがって、ポリペプチド鎖は上方と後方に 2 回伸び、末端に下部サブドメイン β シートの外側鎖 (β14 および β15) を形成します。 下部サブドメインのこれらの二次構造要素は、上部サブドメインに広がる顕著な疎水性コアを包含しており、二次構造含量が低く（表S2）、極性相互作用のいくつかのネットワークによって安定化されています（図S1および表S3）。 ループ 1 ～ 4 (L1 ～ L4) と呼ばれる 4 つの注目すべき突起が上部ドメインから伸びています: ループ 1 (L1、残基 253 ～ 270、β2 と η1 を接続)、ループ 2 (L2、残基 276 ～ 281、η1 と β3 を接続) ）、ループ 3（L3、残基 414 ～ 436、α5 と β9 を接続）およびループ 4（L4、残基 446 ～ 453、β10 と β11 を接続）。 ループ L3 および L4 は、Cα 原子の高い B 因子 (>105 Å2) によって示されるように、構造内で特に可動性です (図 S2)。 電子密度は8つの予測されたN-グリコシル化部位で観察され（図1c）、各部位で少なくとも1つのN-アセチルグルコサミン（NAG）のモデリングが可能になりました（図2および図S3a）。

水平の破線は、下位サブドメインと上位サブドメイン間の境界を示します。 RBDG (RBDD ではない) 構造のみに組み込まれている NAG および MAN ユニットは、赤枠で示されています。 この図は BioRender.com で作成されました。

RBD とその部分構造をクエリとして DALI アルゴリズム 23 を使用して PDB データバンクを検索しても、意味のある結果は得られませんでした。 オルソレトロウイルス由来の RBD の入手可能な構造との比較分析 (図 S4) では、二次構造トポロジーまたは三次元折り畳みのレベルのいずれにおいても、構造の類似性は明らかになりませんでした。 したがって、SFV RBD は、私たちの知る限り、前例のない倍率を表しています。

RBDDとRBDGのX線構造の間に大きな違いはありませんでした（それらを重ね合わせると、構築できる糖単位の数が異なることを除いて、二乗平均平方根偏差（rmsd）が1Å未満になりました（図S3b、c））。上部サブドメインの顕著な特徴は、α4 ヘリックス残基 N390 に結合した 8 番目の N-結合型糖 (N8)18 です。N390 側鎖と結合した最初の 2 つの NAG 残基は埋め込まれています。 N8 グリカンは、RBD 内で EndoH/D 切断部位にアクセスできなくなり（図 3b）、RBDG 内に 10 個の糖残基、脱グリコシル化タンパク質結晶内に 8 個の糖残基を構築できるようになりました（図 2 および 3）。 N390 はその基部にあり、上向きに伸びており、タンパク質と接触したままで、両方の結晶形で同じ立体構造を維持しています。構造分析により、グリカンがその下の残基 (803 Å2 の埋没表面積) と広範なファンデルワールス接触を確立し、 Y394 および I484 の主鎖原子および E361 の側鎖と水素結合します (図 2)。 S5)。 グリカン部分はよく保存された疎水性表面を覆っているため（図3a、b）、RBDフォールドを維持し、凝集を防ぎます。これは、報告されているミスフォールディングと、N8部位に変異がある分泌型PFV SUの低レベルと一致しています18。 N8は、FVサブファミリー全体で厳密に保存されているSUの唯一のN-グリコシル化部位であり（図S6）、その下にある疎水性パッチ残基も同様に保存されています（図3c）。 したがって、N8 はすべての FV RBD において重要な構造的役割を果たしている可能性があります。

a 残基の疎水性によって着色された SFV RBD の分子表面表現。 各残基の疎水性は、Chimera29 の Kyte and Doolittle スケール 66 に従って計算され、グラデーション カラー キーは青色の最低疎水性から黄色の最高疎水性を示します。 部位 N6、N7、N7'、および N9 の糖は白い棒として表示され、N8 に結合した糖はシアンの棒として表示されます。 注入口は、N8 で保護されているグリコシダーゼ Endo D/H によって切断された結合を示しています。 b N390 に結合した N8 糖は疎水性領域をカバーします。 パネル a の破線の四角形内の拡大領域が表示されます。 NAG および MAN 残基には、パネル a の入口に描かれた N-オリゴ糖に対応する番号が付けられています。 c N8 で覆われた疎水性パッチはよく保存されています。 SFV RBD 表面は、11 個の FV Env 配列内の同一残基の割合に従って、Chimera29 の残基保存によってレンダリングされます（アラインメントは図 S6 に示されています）。 表面表示の下のカラーキーに示されているように、配列の 30% 未満と 90% 以上で保存されている残基はそれぞれ白と紫で色付けされ、その間の残基は白と紫のグラデーションで表示されます。

異なる種の RBD 間の潜在的な構造の違いを調査するために、AlphaFold 2 (AF2)24 ソフトウェアを使用して、5 つの FV 属のそれぞれのメンバーから RBD 構造を非経験的に予測しました。そのうちのいくつかは、モジュール性により 2 つの遺伝子型として存在します。 FV Env25の。 各 FV Env 内では、変数または「SUvar」と呼ばれる RBD 内の約 250 残基の長さの領域が、2 つの共循環遺伝子型 I および II を定義しており、これらはゴリラ 26、チンパンジー 19、マンドリル 25 などで見つかっています。 SUvar領域は70％未満のアミノ酸配列同一性を共有していますが（図S6）、残りのEnv残基は高度に保存されています（>95％の配列同一性）。 SUvarは上位サブドメイン内に位置し、ループL1〜L4（GII RBDの残基282〜487、図S6およびS7）を囲みます。

生成されたすべてのAF2モデルは信頼性の高いメトリクスを持ち（図S8）、アミノ酸配列同一性>30％と一致する保存された倍数を示します。 重大な逸脱は、SUvar 内のループでのみ見つかりました。 rmsd とは異なり、長さに依存しない構造類似性の尺度であるテンプレート モデリング スコア (TM スコア) 27 は、比較した 11 個の構造の平均値が 0.89 です。 GII RBD の AF2 モデルと実験的に決定した同じ株の構造は、328 個の Cα 原子のうち 320 個が整列した状態で 0.96 の TM スコアと 1.5 Å の rmsd で重ね合わされており、AF2 モデルの高精度が確認されています。 すべてのペアワイズ重ね合わせについて 4 Å 未満の Cα rmsd 値を持つ残基の集合を含む「共通コア」(CC) は、mTM-align ウェブサーバーによって計算されました28。 FV RBDのCCには、308個の整列した残基のうち239個が含まれており（図S9a）、ほとんどのCC残基は下部サブドメインを形成する二次構造要素に属しています。 上部サブドメインのループは、ほとんどが CC の一部ではありません (図 S9)。

三量体 Env 内の RBD の配置を調査するために、我々は、Foamy ウイルス ベクター (FVV) 粒子上で発現された三量体 PFV (チンパンジー遺伝子型 I FV) Env について報告されている 9 Å クライオ EM マップに RBD 原子モデルを当てはめました 13。 このフィッティングは、ゴリラとチンパンジーの RBD 間の高度な構造保存によって正当化され、GII RBD 構造と予測された PFV RBD モデルの重ね合わせの TM スコア 0.88 によって示されました (図 S8)。

RBD フィッティングは、材料と方法で説明されているように、Chimera suite29 の Fit-in-map 機能を使用して実行されました 29 (図 4a)。 相関係数 0.96 は、組換え発現された RBD がウイルス粒子の表面で観察される生物学的に関連した立体構造を表すことを強く示唆しています。 RBDD構造で解析できた7つのN結合型グリカンはすべて完全に溶媒にさらされており（図4b）、N5、N6、N7、N8、N9に結合した糖のPFV EMマップでは追加の密度が観察されました。および N11、RBD の配置を検証します (N7' 部位は PFV Env に存在せず、この部位では余分な密度は観察されませんでした)。 RBD の N 末端と C 末端は膜の方向を向いており、以前に示唆されているように、Env 密度の下半分が TM サブユニットと残りの SU 残基によって占められていることを示しています 13。

a 3 つの SFV RBDD プロトマーは、ウイルスベクター粒子上で発現された全長 PFV Env のクライオ EM 3D 再構成によって得られた 9 Å クライオ EM マップ (EMBD: 4013) にフィットしました13。 マップは明るい灰色の表面で示され、RBD は漫画モードで示され、各プロトマーは異なる色 (黄色、白、水色) で示されます。 b パネル a で説明したようにフィッティングした 3 つの RBD は、HS 結合残基 (K342、R343、R359、R369) および N 結合グリコシル化 (N6、N7) を保持する α2 および η4 ヘリックスを示すために示されています。 、N7'、N8、N9 および N11) は外側を向いており、溶媒にアクセスできます。 左側のパネルの四角で囲まれた領域が拡大されて、右側のパネルに表示されます (わかりやすくするために、白で着色された 1 つのプロトマーのみが示されています)。 c 三量体 RBD 配置を上から見た図、つまり膜から見た図 (左) と下から見た図、つまり膜から見た図 (右) を示します。 RBD は、上部ドメインの L1 ～ L4 を介してプロトマー間接触を形成します。 各プロトマーに属するループは、L、L'、および L'' として指定されます。画像は Chimera29 で生成されました。

3つの適合したRBDは、Envの頂点（膜遠位領域）の中央空洞の周りに配置されています（図4a）。 PDBePISA30で行われた三量体RBDモデルの高分子表面の解析により、RBDで環状構造を形成するループL1～L4によって確立される限られたプロトマー間界面（RBD溶媒接触可能表面全体の<10%）が明らかになりました。頂点に達し、RBD の大部分が露出したままになります (図 4b)。 このモデルによると、3 つの L1 ループはおそらく RBD の中心で同型相互作用を起こして内側のリングを形成し、各 L3 ループは隣接するプロトマーの L4 および L2 と接触します。 非共有結合を形成する可能性があるドッキングモデルの界面の残基（図S10b、c）とループ領域の長さ（図S9aおよびS10a）は、FVファミリー全体であまり保存されていません。 PFV Env TM サブユニットが三量体化して、すべてのクラス I 融合タンパク質の特徴である顕著な中央コイルドコイル 13 を形成していることに注目することが重要です。 したがって、RBD 間に確立される潜在的な界面は、寄与する Env 三量体化部位の 1 つだけになります。

Env 機能に対するループの重要性を評価するために、ループ L2 および L4 (それぞれ ΔL2 および ΔL4) を削除した GII Env を含む FVV を生成しました。 WT Envを含むFVVと比較して、分泌された変異体FVV粒子の量は50倍以上減少し（図S11a）、細胞への結合は2〜4倍減少しました（図S11a）。 しかし、両方の変異体の感染力は我々のアッセイの検出限界を下回っていました（図S11c、d）。これは、配列の保存が不十分であるにもかかわらず、ループL2およびL4がEnvの活性に関連する構造的および/または機能的役割を果たしていることを示しています。

RBD内の潜在的なHS結合領域の位置を特定するために、静電ポテンシャルの表面分布を調査し、強い正の電位を持つ下部サブドメインに大きな連続した表面パッチを特定しました（図5a）。 次に、HS 四糖をタンパク質表面にドッキングすることで推定上の HS 結合部位を予測する ClusPro サーバーを使用して RBD 構造を分析しました 31。 ヘリックスα2のK342およびR343、前方のヘリックスη4のR359、および延長鎖領域のR369は、表面にドッキングされたHSモデルとの接触回数が最も多かった残基の1つでした（図5b、c）。 4 つの残基は、下部サブドメインの正に帯電した領域内にもマッピングされました。

a 静電ポテンシャル分布は、Pymol65 の Adaptive Poisson-Boltzmann Solver モジュール 67 を使用して計算され、RBD の溶媒が除外された表面上にプロットされました。赤は負の電位に対応し、青は正の電位に対応します (左 2 つのパネル)。 ClusPro31 によってモデル化された HS 分子の集合体は、下のサブドメインにマッピングされ、2 つの右側のパネルに棒で表示されます。 RBD は、予測される HS 結合二次構造要素の位置を示すために、漫画モデルと 2 つの方向で示されています。 b ClusPro によって計算され、各 RBD 残基についてプロットされた、残基ごとおよび側鎖原子ごとの予測接触数。これにより、HS 結合に関与する可能性が最も高い候補が明らかになります。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。 c RBDの構造は漫画で示されており、α2およびη4ヘリックスを含む領域が灰色で強調表示されています。 灰色の枠で囲まれた領域の拡大図が右パネルに示されており、関連する二次構造要素と予測されるHS結合残基が棒で示されています。 2 つのジスルフィド結合は黄色の丸で示されます。 この図は Pymol65 と BioRender.com を使用して作成されました。

ClusProの予測に基づいて、2つのGII RBDバリアント（「mut1」と呼ばれるK342 / R343、および「mut2」と呼ばれるR359 / R369）を作成し、セファロースマトリックス上に固定化されたHSへのそれらの結合をテストしました（図6a）。 2つのRBDバリアントは、モノマーの予想サイズと一致するサイズ排除クロマトグラフィーで同じ体積で溶出しました（図S12）。これは、導入された変異がタンパク質のミスフォールディングを引き起こさないことを示しています。 WT RBD はヘパリン カラム上に保持され、300 mM 塩化ナトリウム濃度で溶出しましたが、mut1 および mut2 変異体は保持されず、フロースルー画分に溶出しました。 観察されたヘパリン結合能力の喪失は、残基 K342、K343、R359、および R369 が HS との相互作用に直接関与していることを強く示唆しています。

組換えSFV RBD、WT（赤色）およびHS結合残基に変異を有する変異体のヘパリンセファロースクロマトグラム、青色はmut1（K342A/R343A）、緑色はmut2（R356A/R369A）。 点線は塩濃度を示し、右側の y 軸にプロットされています。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。 b HT1080細胞への組換えWT RBDおよびEnv細胞外ドメインの結合。 SFV RBD および外部ドメイン結合レベルは、タンパク質処理細胞と未処理細胞の MFI の比として表されました。 RBD と比較できるように、細胞外ドメインの濃度が計算され、単量体タンパク質についてプロットされます。 ゲーティング戦略を(図S13a)に示します。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。 c WT、mut1 (K342A/R343A)、およびmut2 (R356A/R369A) 組換えEnv細胞外ドメインのHT1080細胞およびBHK-21細胞への結合。 生存単一細胞へのSFV Env結合レベルは、タンパク質処理細胞と未処理細胞のMFIの比として表されました（図S13b）。 2 つの独立した実験からの平均が示されています。 2つの実験のそれぞれの日に細胞HS発現レベルをモニタリングしました（HS染色レベルは、HT1080細胞については85.4および61.6、BHK-21細胞については8.40および2.68でした（図S13c））。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。 d ヘパリナーゼまたはバッファーで処理したHT1080細胞へのWT、mut1 (K342A/R343A)、およびmut2 (R356A/R369A) 組換えEnv細胞外ドメインの結合を、細胞外ドメイン濃度を増加させて定量しました。 生存単一細胞への細胞外ドメイン結合レベルは、タンパク質処理細胞と未処理細胞のMFIの比として表されました（図S13b）。 2 つの独立した実験からの平均値が示されています。 HS表面発現と除去は、HSおよびΔHS特異的抗体によって定量化されました（図S13d）。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。 e WT (赤)、mut1 (青)、および mut2 (緑) Env を保持する FVV の 5 つのバッチが生成されました。 各バッチは単一のドットで表されます。 黒い線は平均値を示します。 WT、mut1、またはmut2 Envを保有する感染性FVV粒子の割合は、感染性粒子の数（感受性細胞での滴定によって決定、図S14a）とRT-qPCRによって得られたベクター粒子の量との比として計算されました（図S14a）。 Ｓ１４ｂ）。 変異体 FVV を、二元配置対応 t 検定を使用して WT FVV と比較し、p 値をグラフに示しました。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。 f WT、mut1またはmut2 Envを保有するFVVのHT1080細胞への結合。 3 つのバッチの FVV を、異なる粒子数/細胞比で HT1080 細胞とともに氷上で 1 時間インキュベートした後、残りのベクター粒子を洗浄し、RT-qPCR によって定量しました。 点線は定量化の閾値を表します。 変異体を保有する FVV と WT Env を、二元配置対応 t 検定を使用して比較し、p 値をグラフに示しました。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

フローサイトメトリーを使用して、細胞上のGII RBDとHSの間の相互作用を調査しました（図S13a）。 我々は、単量体RBDが高タンパク質濃度であってもHT1080細胞に結合しないことを発見した（図6b）。 そこで我々は、自発的に三量体を形成するより長い構築物であるGII Env外部ドメインをテストし、オリゴマーが結合活性効果によりより高いシグナルを生成するという仮説を立てた。 三量体外部ドメインはHT1080細胞に結合したため（図6b）、K342A / R343AおよびR356A / R369A変異（それぞれmut1およびmut2）が外部ドメインのバックグラウンドに導入され、フローサイトメトリー実験に適したものになりました。 我々は、どちらもゴリラFVによる感染を受けやすい、HT1080細胞およびBHK-21細胞へのEnv外部ドメインの結合を比較しました（図6c）。 結合実験と同時にフローサイトメトリーによってHS発現レベルを定量化し、報告されているように、BHK-21細胞がHT1080細胞よりも低いHSレベルを発現することを確認しました17（図S13c）。 HS発現レベルは、HT1080細胞と比較してBHK-21細胞で10〜30倍低く（図6c）、BHK-21細胞へのWT細胞外ドメインの結合は、試験した最高タンパク質濃度でHT1080細胞よりも低かった。 結合シグナルは用量依存性であり、両方の細胞株のWTタンパク質と比較して、mut1およびmut2外部ドメインバリアントでは1 log低かった（図6c）。

設計された変異が細胞のHSとの相互作用に特に影響を与えたことを証明するために、細胞からHSの90％以上を除去するヘパリナーゼで前処理したHT1080細胞への結合を測定しました（図S13d）。 ヘパリナーゼ処理細胞へのWT外部ドメインの結合は、緩衝液処理細胞と比較して約100倍減少しましたが、ヘパリナーゼ処理とは無関係に、mut1およびmut2バリアントは結合しませんでした（図6d）。

HS へのウイルス結合における残基 K342、R343、R356、R369 の重要性を、表面に WT、mut1 または mut2 Env のいずれかを発現する FVV を使用してテストしました。 RT-qPCRによって測定された、トランスフェクトされた細胞によって放出されたFVV粒子の総数は、WT FVVと比較してmut1では約6倍低かったが、mut2はWTと同じ粒子産生を示した（図S14a）。 感染力価は、WTと比較して、mut1およびmut2でそれぞれ34倍および65倍低かった(図S14b)。 FVVの総数（図S14a）で割った感染性粒子の割合、感染力価（図S14b）は、WT Env FVVの場合は0.7％でしたが、mut1およびmut2 FVVの値は3倍および22倍でしたそれぞれ下にあります（図6e）。 RT-qPCRによって細胞へのFVVの結合を測定したところ、WT Env FVVと比較して、mut1およびmut2 Envを保有するFVVでは結合がそれぞれ3倍および23倍減少していることがわかりました（図6f）。 したがって、細胞への結合および侵入レベルは、HS結合部位に変異を有するEnvタンパク質を保有するFVVについて同程度に減少した。

組換えEnvタンパク質（図6c、d）および全長Envを保有するFVV（図6f）について記載された結果は、生化学データ（図6a）と一致し、残基K342、R343、R356、R369が重要な役割を果たすことを示しています。ウイルスとHSの相互作用において重要な役割を果たします。

我々は、ゴリラのFVから得たRBDのX線構造を決定し、入手可能なオルソレトロウイルスのRBD構造、すなわちフレンドマウス白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ヒト由来のRBDとは異なる三次元の折り畳み（図1および2）を明らかにした。内在性レトロウイルス EnvP(b)1 (ガンマレトロウイルス属)32、33、34、および HIV35 (レンチウイルス属) 由来の gp120 (図 S4)。 この発見は、オルソレトロウイルスには共有されていない独自の FV 特徴 (集合、粒子放出 36、複製 37) のレパートリーを拡大するものであり、オルソレトロウイルス亜科とスプマレトロウイルス亜科の間で Env 配列が保存されていないことを考慮すると驚くべきことではありません。

一部のオルソレトロウイルスの RBD については、構造情報が入手可能です。 ガンマレトロウイルスの場合、RBDは比較的小さく（〜200残基）、2つの拡張ループを持つ逆平行βサンドイッチに折り畳まれ、βサンドイッチの上に位置するらせん状のサブドメインが生じます33（図S4）。 。 らせん状のサブドメインは細胞受容体の指向性を定義し 38 、属内で高い配列変動性を示します。 対照的に、HIV などのレンチウイルスは、gp120 と呼ばれる SU サブユニットの大部分を含む、より大きな受容体結合領域 (約 450 残基) を持っています。 HIV は、gp120 を介して同族受容体 CD4 と相互作用します。gp120 は、内側と外側の 2 つのサブドメインに折り畳まれており、両方のサブドメインの二次構造要素によって形成される受容体結合表面を備えています 35。 gp120 コアから突き出た可変ループは、受容体結合、免疫回避に関与し 39、Env 構造動態の重要な役割を果たします。 この環境の「呼吸」には、gp120 サブユニットとループの異なる配置が必要です。閉じた状態（ループが接触を形成する）、弛緩した状態（より大きな開放度を伴う）、および開いた状態（CD4 受容体結合後に達成されます）40。 41. オルソレトロウイルスの RBD と FV の RBD を比較することにより、FV RBD のグローバルな 2 つのサブドメイン (よりよく保存されている下位ドメインと、突出したループを含み配列が可変である上位ドメイン) に分けられることを思い出させると主張することができます。オルソレトロウイルスの RBD について上記で説明した特徴を説明します。 HIV および FV の Env SU に同様の特徴が存在することが、受容体結合および立体構造の柔軟性におけるループの同様の機能を意味するかどうかは、まだ解明されていません。

実験的に決定したRBD構造を、FVV粒子上で発現した三量体PFV EnvのクライオEM単一粒子再構成によって得られた低解像度マップ（図4a）に当てはめました。 得られた RBD 三量体配置のモデルは、ここで提示した生化学的および機能的データと一致しています。つまり、予想通り、HS 結合残基 (K342、R343、R356、R369) および 7 つの N 結合炭水化物が、露出している Env 表面にマッピングされています。溶媒に移します（図4c）。 私たちのモデルによると、各プロトマーの上部サブドメインの上部に位置する L1 ～ L4 ループは互いに近接しており (図 4)、そのすぐ下に、低温ではっきりと見える空洞が残っています。 EMマップ13． これらの観察に基づいて、我々はプロトマー間相互作用が融合前の Env 立体構造の維持に関与していると推測しました。 我々は、ループL2およびL4に欠失のあるEnv変異体を保有するFVVをテストし（図S11）、これらの変化は細胞へのFVV結合にわずかな影響を与えたが、感染力の完全な喪失をもたらしたことを示し、ループ欠失を持つEnvが感染した可能性を裏付けた。融合不活性な融合後の立体構造に容易に移行する可能性があります。

ループ配列は FV ファミリー全体であまり保存されておらず、長さが異なります (図 S9 および S10a)。 11のFV RBDのAF2モデルの重ね合わせにより、ループを含む可変領域に限定されたわずかな構造の違いが明らかになりました（図S8およびS9）。 三量体 Env の RBD 間の界面の残基の保存性が低いことは、選択圧が弱いことを示唆しており、Env のネイティブ状態が異なる FV の相互作用するループ残基の異なるセットに依存していることを示している可能性があります。 あるいは、RBD-RBD 界面には主鎖原子間の極性相互作用が関与している可能性がありますが、RBD の表面が界面に埋め込まれているのはごくわずかであることを考えると、極性相互作用が多数であるとは予想できません。 RBD が緩く結合していることの利点は、エンドソーム (酸性 pH) 内および/または特定の細胞受容体によって送達される融合トリガーによる解離を促進することです。 その点で、FV RBD ループは、立体構造の柔軟性を提供する HIV Env の V1/V2/V3 ループと同等の役割を果たす可能性があります 40,41。 エンドソーム内で融合する他のすべての FV と比較して、PFV で使用される原形質膜での膜融合を駆動する RBD 分子決定基が存在する場合、それを識別することも重要です 11。

SU 切断変異体の細胞に結合する能力に基づいて、Duda et al. は、PFV EnvのRBDを残基225〜55518（ゴリラGII Envでは残基226〜552（図S15a））にわたる領域として定義しました。 提案された領域内では、中央セグメントは細胞結合活性には不要であることが判明した18。 このセグメント（RBDjoin42とも呼ばれます）はループL3とL4を包含し、RBDの上部にマップされ、2つのジスルフィド結合によってクランプされています（図S5およびS15a）。 HS 結合残基から離れたその位置は、同等の領域を欠く PFV SU トランケーションが WT タンパク質について測定されたレベルで細胞に結合する能力と一致しています 18。 RBDjoin領域を欠くPFV RBDのAF2モデルは、実際に、完全なRBDのものと非常によく似た3D折り畳みを明らかにしています（図S15b）。 対照的に、我々は、三量体 GII Env の状況において、ループ L2 および L4 の欠失が感染力に重大な影響を与えることを示し、可溶性 RBD と完全長 Env 三量体内の RBD の異なる挙動を強調しています。

我々のデータは、K342/R343およびR356/R369が、不活性マトリックス上に固定化された、または細胞上で発現されたHSとRBD相互作用の重要な残基であること（図6）、およびHSがゴリラFVの付着因子であることを実証しており、これまでの報告を拡張しています。 PFV17用。 4 つの変異 (K342A、R343A、R356A、および R369A) を持つ組換え SFV GII RBD の発現収率は非常に低かったが、予想通りヘパリン カラムに結合しませんでした。 SFV Envでは、ゴリラGII Envの343位に相当する残基は常にアルギニンまたはリジンですが、アルギニンは356位で厳密に保存されています（図S6）。 342 位と 369 位の残基は、通常、正または極性の残基に囲まれていますが、FV Env 間ではあまり保存されていません。 これは、R343 と R356 がすべての FV の HS 結合に重要である可能性がある一方、各ウイルスに特異的で、パッチ内の高い正の静電電位を持つ他の場所に位置する他の正に帯電した残基が、ウイルス特異的な HS 結合に寄与している可能性があることを示唆しています。コンテキスト (図 5a)。

FV 受容体の存在は、Plochmann らによって提案されていました。 HS が真の FV 受容体として機能することも提案されていますが、HS が完全に欠如しても FV 感染は廃止されませんでした。 HSを欠く細胞への残留Env結合は、WTおよびHS結合障害変異体の両方で観察されましたが（図6d）、FV侵入における追加の細胞受容体の存在と一致しています。 私たちが生成したHS結合欠損Env変異体は、広く発現している付着因子であるHSへの結合を排除するため、潜在的なタンパク質性受容体の探索に有用なツールとなるでしょう。

GII RBD X 線構造を PFV Env EM マップにフィッティングすることで得られた高い相関係数は、三量体モデルにおける RBD ループの一般的な位置が有効であることを強く示唆しています。 しかし、異なるウイルス (PFV) について得られた低温 EM マップに GII RBD 結晶構造を低解像度 (9 Å) で当てはめたため、それらが確立する接触残基と相互作用は正確に推測できず、側鎖の精製ができません。 。 さらに、すべてのRBDループは高いB因子を持ち（図S2）、7残基はL3に構築できませんでした。 AF2 は他の FV RBD のループ内の残基に低い pLTTD 値を割り当てたため、それらの RBD 界面での接触残基の同定も不可能でした。

我々のデータは、L2およびL4が侵入時のEnv活性にとって重要であることを示しているが、Envの安定性および融合前立体構造に対するこれらの領域の重要性を推定するための直接的な証拠は提供していない。 低解像度マップでフィッティングを実行したため、HIV Env43 の gp120 と同様に、Env 三量体の文脈において、RBD がさまざまな程度の開放性を採用できる可能性も排除できません。 Env 内の RBD 界面と融合前状態の立体構造安定化におけるその役割を明確に同定するには、全長 Env 三量体の原子分解能構造が必要です。 私たちはAF2による三量体完全長Envの構造の予測を試みましたが、Envプロトマーのサイズが大きい（ほぼ1000残基）ことと、アクセスできるサーバーの計算制限により、その試みは成功しませんでした。

この原稿では、FV RBD の最初の X 線構造を説明し、新しい折り畳みがネイティブ FV Env で採用されたものであることを検証しました。 我々は、RBD内で、構造、保存、機能の観点から2つのサブドメインを同定した。1つは遺伝子型特異的領域の大部分を含む上部サブドメイン、もう1つはより保存された下部サブドメインで、アタッチメント因子HSへの結合に重要である。 。 追加の 10 個の FV RBD の AF2 モデルを生成し、その保存された三次元立体構造を強調しました。 この情報はウイルスと細胞の相互作用を理解するために重要であり、Dynesen et al.42 に記載されているように、FV の侵入と中和抗体による認識の分子基盤を確立するために必要な構造駆動型突然変異誘発研究の枠組みを提供しました。 AlphaFold24 アルゴリズムでは、糖タンパク質の表面におけるオリゴ糖の配置を予測できません。 以前に報告された FV Env の機能観察と N8 の役割は、実験的に導出された構造に照らして理解できるようになり、実験的手段による構造決定の必要性が強調されます。 HS 結合残基の同定は、さらなる推定上の FV 受容体の探索に役立ちます。 準安定、多量体、高度にグリコシル化された FV Env の構造と機能の関係を洞察し、受容体活性化と膜融合の分子基盤を解明するには、統合された生物学の取り組みと実験的構造手法が必要です。

フローサイトメトリーアッセイは Duda らによって開発されました。 組換え発現されたフォーミーウイルス Env 変異体の細胞への結合を検出するため 18。 著者らは、マウスIgGのFc領域（イムノアドヘシン）に融合したSU切断のパネルを使用することにより、細胞への結合に十分なPFV Envの最小領域として定義されるRBDが残基225から555（残基226に対応）を包含することを示した。ゴリラFV RBD（GII-K74株、アクセッション番号JQ867464）44（図S6））の552まで。 SFV RBD の表現構造を設計する際、Phyre2 Web サーバーによって生成される二次予測も考慮しました45。 残基I225は推定上のヘリックス（残基220〜230）の中央にあったため、コンストラクトのN末端として上流の残基R218を選択することになりました（図1aおよび図S6）。

Phyre2 ウェブサーバーによって取得された二次構造予測に関する情報は、最初に予測された膜貫通ヘリックス (S91) の後に始まり、I905 までの残基を含む Env 外部ドメイン構築物の設計にも使用されました。

構造研究のために、RBD (残基 218 ～ 552、GII-K74 株、Env アクセッション番号 JQ867464) を、二価陽イオン誘導性メタロチオネイン プロモーターを含む、pT350 と呼ばれる改変 pMT/BiP 昆虫細胞発現プラスミド (Invitrogen) にクローニングしました。 N 末端の BiP シグナルペプチド (MKLCILLAVVAFVGLSLG)、および C 末端のダブル Strep タグ (DST) (AGWSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEK)。 このプラスミドは、ピューロマイシン選択用の pCoPuro プラスミドとともにショウジョウバエ シュナイダー ライン 2 細胞 (S2) に同時トランスフェクトされました 47。 この細胞株は、7 μg/ml ピューロマイシンおよび 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを含む無血清昆虫細胞培地 (HyClone、GE Healthcare) で選択されています。 タンパク質生産段階では、細胞をスピナーフラスコ内で密度が約 1 × 107 細胞/ml に達するまで増殖させ、その時点でタンパク質発現を 4 μM C​​dCl2 で誘導しました。 6日後、細胞を遠心分離により分離し、上清を濃縮し、StrepTactinカラム(IBA)を使用するアフィニティー精製に使用した。 S2 細胞培養液 1 リットルあたり約 20 ミリグラムの組換え RBD が得られました。 １０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ ２ 、ｐＨ８．０中でタンパク質を６４ユニットのエンテロキナーゼ軽鎖（ＢｉｏＬａｂｓ）とともに室温で一晩インキュベートすることによってＤＳＴを除去した。 タンパク質分解反応物を10 mM Tris、100 mM NaCl、pH 8.0に緩衝液交換し、再度アフィニティー精製を行って、タグのないRBDを含む素通り画分を回収した。 タンパク質を濃縮し、50 mM 酢酸ナトリウム、200 mM NaCl、pH 5.5 中で 1000 ユニットの各グリコシダーゼと一晩インキュベートした後、EndoD および EndoH による酵素的脱グリコシル化を室温で設定しました。 このタンパク質をさらに、10 mM Tris、100 mM NaCl、pH 8.0中のサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）カラムSuperdex 200 16/60（Cytiva）で精製し、VivaSpin濃縮器で8.2 mg/mlまで濃縮し、そのまま結晶化試験に使用しました。 。

細胞結合実験のために、哺乳動物細胞での発現のために、RBD 構築物を pcDNA3.1(+) 由来のプラスミドにクローン化しました。 発現プラスミドは、組換えタンパク質の発現を増加させる CMV エクソン - イントロン - エクソン配列を挿入することによって改変されました。 RBD は、C 末端にエンテロキナーゼ切断部位と DST タグを備えた CD5 シグナルペプチド (MPMGSLQPLATLYLLGMLVASCLG) の下流にクローニングされました。 HS 変異体は、部位特異的変異誘発によって生成されました。 組換えタンパク質をコードするプラスミドを、製造業者の指示に従って、FectroPRO® DNA トランスフェクション試薬 (Polyplus) を使用して Expi293FTM 細胞 (Thermo Fischer) に一時的にトランスフェクトしました。 細胞を37℃で5日間インキュベートした後、培養物を遠心分離しました。 タンパク質を、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎカラム（ＩＢＡ）を使用するアフィニティークロマトグラフィー、続いて１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００カラム（Ｃｙｔｉｖａ）でのＳＥＣにより上清から精製した。 単量体タンパク質に対応するピークを濃縮し、使用するまで -80 °C で保存しました。

WT ゴリラ GII FV 外部ドメインを pT350 ベクターにクローン化し、部位特異的突然変異誘発によってヘパラン硫酸結合変異体を生成するためのテンプレートとして使用しました。 ショウジョウバエ S2 細胞は、上記のようにベクターで安定にトランスフェクトされました。 細胞外ドメイン発現は、RBD産生について報告されたのと同じ手順に従い、6日後、StrepTactinカラム(IBA)および10mM Tris中のSuperose 6 10/300カラム(Cytiva)上のSECを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって細胞上清から精製した。 、100 mM NaCl、pH 8.0。 三量体外部ドメインに対応するピーク内の画分を VivaSpin 濃縮器で濃縮し、使用するまで -80 °C で保存しました。

結晶化試験は、Mosquito ロボットを使用して、96 枚の Greiner プレートの形式で等量のタンパク質とリザーバー溶液を混合することによって形成された 200 ナノリットルのシッティング ドロップで実行されました。 結晶の外観と成長は、フランス、パリのパスツール研究所のタンパク質結晶化の中核施設にあるロックイメージャーによって監視されました48。 データ収集に使用したネイティブ RBDD 結晶は、0.1 M Tris pH 8.5、3.5 M ギ酸ナトリウム (NaCOOH) 中で成長させました。 派生データの場合、0.1 M Tris pH 8.5、3.25 M ギ酸ナトリウム中で成長させた RBDD 結晶を、0.5 M ヨウ化ナトリウムを補充した同じ結晶化溶液に一晩浸漬し、33% エチレングリコールを含む母液を低温として使用して直接凍結しました。 -バッファ。 RBDG 結晶は、0.2 M 酒石酸アンモニウム ((NH4)2 C4H4O6) および 20% w/v PEG 3350 を含む溶液から得られました。

X 線回折データは、SOLEIL シンクロトロン源 (フランス、サントーバン) で収集されました。 RBDD および RBDG のネイティブ データは、Proxima-149 ビームラインで 100 K、波長 0.9786 Å で収集されましたが、RBDD の派生データ (ヨウ素浸漬) は、Proxima-2A で波長 1.907 Å で収集されました。 ビームラインには、それぞれ Pilatus Aiger X 16 M 検出器とEiger X 9 M 検出器 (Dectris) が装備されています。

我々は、RBDD (2.57 Å) の三方晶系結晶、RBDD (2.57 Å) の空間群 3221、誘導体 RBDD (3.2 Å) の P3121 (後に P3221 であることが判明)、および RBDG タンパク質の六方晶系結晶 (2.8 Å、空間群 P61) を取得しました。 回折データは XDS50 を使用して処理され、AIMLESS51 でスケーリングおよびマージされました。 高解像度のカットオフは、統計指標 CC1/252 に基づいています。 CCP4 スイートのいくつかのアプリケーションが処理全体を通して使用されました53。 統計を表 S1 に示します。

位相は単一波長異常回折によって実験的に決定されました。 Phenix スイート 54,55 の AutoSol パイプラインが採用され、異常なデータセットを使用してヨウ素部位を検索し、非対称ユニット (ASU) 内の 2 つの NCS コピーを指定しました。 AutoSol は、20 個のヨウ素部位で構成される部分構造を確実に決定しました。 精製された異常相は、密度変更を利用してタンパク質全体の位相を調整するために内部的に使用されました。 このプロセスの結果、R 係数が低い構造が得られました。 さらに、密度を修正したマップは、タンパク質と溶媒の間の良好なコントラストを示し、らせん状の特徴がはっきりと識別できました。 セル内に存在するねじ軸により 2 つの選択肢 (P3121 または P3221) が考慮されるため、異常データの空間群の最初の割り当ては暫定的なものでした。 エナンチオモルフのあいまいさは、異常相による密度変更と、マップとその品質を確認することによるモデル構築の後に解決されました。 AutoSol は、P3221 という正しい空間グループを明確に選択しました。 この構造は、AutoSol からの密度修正マップと AutoSol からの洗練された下部構造を使用して、「実験フェーズ」モードの Buccaneer56 でさらに改善されました。 最後に、BUCCANEER モデルは、phenix.refine54、BUSTER57,58、および Coot59 の反復ラウンドによって 2.57 Å のネイティブ データに対して改良されました。これは、すべてのモデル構築と改良を通じて、モデルを検査して手動で修正するために使用されました。

RBDG の構造を解明するために、RBDD 構造が Phenix スイートの Phaser60 の Molecular Replacement の検索モデルとして使用されました。 この場合、ASU には 2 つの分子が含まれていることが判明し、BUSTER と phenix.refine の組み合わせを使用して再度精製されました。

どちらのモデルでも、2Fo-Fc および Fo-Fc 電子密度差マップを使用して炭水化物部分を明確に特定し、構築しました。 両方のモデルについて、最終的な立体化学は MolProbity (http://molprobity.biochem.duke.edu/)61 によって評価されました。

最終的なマップは、これら 7 つのアミノ酸に基づく構築を妨げる残基 420 ～ 426 を含む領域を除いて、明確で解釈可能な電子密度を示し、この領域の固有の柔軟性を示しました。 原子モデルは、RBDD 結晶と RBDG 結晶について、それぞれ Rwork/Rfree が 0.21/0.25 と 0.19/0.23 に改良されました。 RBDD モデルと RBDG モデルには、ラマチャンドラン プロットの優先領域内に 95.99% と 95.69% の残基があり、外れ値はそれぞれ 0.31% とゼロでした。

RBD フィッティングは、RBDD モデル (PDB: 8AEZ) と PFV Env13 で取得された 8.8 Å EM マップ (EMD-4013) を使用して、Chimera suite29 の Fit-in-map 機能で実行されました。 フィッティングに使用されたマップは、9 Å の分解能で原子からシミュレートされ、マップ等高線レベル 0.025 を超えるデータから、相関係数 0.96 が得られました。 図 4 を準備するために、ほとんどのグリカンの密度を視覚化できるように、等高線レベル 0.014 が選択されました。

ベビーハムスター腎臓 (BHK)-21 細胞 (ATCC-CLL-10) を DMEM-グルタマックス-5% ウシ胎児血清 (FBS) (PAA Laboratories) 中で培養しました。 HT1080 細胞 (ECACC 85111505) を、1x l-グルタミンおよび 1x 非必須アミノ酸 (NEAA) を補充した EMEM-10% FBS 中で培養しました。 ヒト胎児腎臓 293T 細胞 (CRL-3216) を DMEM-グルタマックス-10% FBS 中で培養しました。

泡状ウイルス分離株は改訂された分類法に従って命名され 22、ゴリラおよびチンパンジー株には短縮名が使用されました 19。 4 成分 FVV システム (プラスミド pcoPG、pcoPP、pcoPE、pcu2MD9-BGAL (β-ガラクトシダーゼをコードする転移プラスミド))、および人畜共通感染症 GI-D468 (JQ867465) および GII-K74 (JQ867464) の配列を含むゴリラ Env コンストラクト) env 遺伝子 (EnvGI-SUGII) が記載されています 19,42。 簡単に言うと、我々が使用した遺伝子型 II Env コンストラクト (EnvGI-SUGII19) は、GII-BAK74 遺伝子型由来の SU と、GI 株 BAD468 由来の LP および TM で構成されており、後者の 2 つは GI と GII の間で非常に保存されています。

RBD の予測ヘパラン硫酸結合部位 (K342A/R343A および R356A/R369A) の変異を、完全長 GII Env を含むこのゴリラ Env プラスミドに導入しました。 Env ΔL2 および ΔL4 変異体は、それぞれ残基 278 ～ 293 および 442 ～ 458 を欠き、グリシン リンカー (ΔL2 については GGGG、ΔL4 については GG) によって置き換えられました。 FVVは、4つのプラスミド(gag:env:pol:導入遺伝子β-ガラクトシダーゼ)を8:2:3:32の比率で同時トランスフェクションすることによって産生されました。 3 マイクログラムの総 DNA と 8 μl のポリエチレンイミン (JetPEI、#101-10N、Polyplus、Ozyme) を、6 ウェル プレートに播種した 0.5 × 106 HEK 293T 細胞に添加しました。 トランスフェクションの 48 時間後に上清を収集し、1500 × g で 10 分間清澄し、単回使用のアリコートとして -80 °C で保存しました。 ベクターの感染力は、BHK-21 細胞にベクターの 5 倍段階希釈液を形質導入し、37 °C で 72 時間培養した後に β-ガラクトシダーゼの発現を検出することによって測定しました。 プレートを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の０．５％グルタルアルデヒドで室温で１０分間固定し、ＰＢＳで洗浄し、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭフェリシアン化カリウム、１０ｍＭフェロシアン化カリウムおよび０．８Ｍを含有する１５０μｌのＸ－ｇａｌ溶液で染色した。 mg/ml 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-BD-ガラクトピラノシドの PBS 溶液、37 °C で 3 時間。 計数は、S6 Ultimate Image UV 分析装置 (CTL Europe、ドイツ、ボン) で行われ、1 つの青い細胞が 1 つの感染単位として定義されました。 FVVによる細胞形質導入はウイルス感染力の代用であり、FVV力価は感染単位/mlとして表されました。

FVV 粒子の収量は、粒子関連導入遺伝子 RNA の定量化によって推定されました。 FVV RNAは、QIAamp Viral RNA Extraction Kit (Qiagen)を用いて生の細胞上清から抽出されました。 メーカーの指示に従って、RNAをDNAフリーキット(Life Technologies)で処理し、ランダムプライマー(Thermo Fischer Scientific)を使用してMaxima H Minus Reverse Transcriptase (Thermo Fischer Scientific)で逆転写した。 BGAL プライマー (BGAL_F 5' AAACTCGCAAGCCGACTGAT 3' および BGAL_R 5' ATATCGCGGCTCAGTTCGAG 3') を使用し、95 °C で 10 分の変性ステップと 40 増幅サイクル (95 °C で 15 秒、60 °C で 20 秒) で cDNA に対して qPCR を実行しました。 Eppendorf realplex2 Mastercycler (Eppendorf) を使用して実行されました。 pcu2MD9-BGAL プラスミドの段階希釈で作成した標準曲線を使用して、FVV のコピー数を決定しました。 各粒子が導入遺伝子の2コピーを保持していることを考慮して、結果はベクター粒子/mlとして表されました。

サーバー ClusPro (https://cluspro.org/login.php) は、潜在的なヘパリン結合部位を特定するために使用されました 31,62,63,64。 サーバーは、FV RBDにドッキングされた完全硫酸化四糖ヘパリンフラグメントの13のモデルと、図5bのプロットを生成するために使用されたヘパリン鎖とタンパク質残基間の原子間接触のリストを生成しました。

100 マイクログラムの組換え FV RBD (野生型、R356A/R369A、K342A/R343A) を、ランニングバッファー (10 mM Tris、100 mM NaCl) であらかじめ平衡化したヘパリンセファロースカラム (Cytiva) に 1 ml/分で注入しました。 、pH 8.0）。 洗浄後、溶出緩衝液（10 mM Tris、2 M NaCl、pH 8.0）の直線勾配（30分間で0から50％）を適用した。

HT1080 および BHK-21 接着細胞をトリプシン-EDTA で剥離し、条件ごとに 5 × 105 個の細胞を使用しました。 細胞の洗浄と染色のステップは、PBS、0.1% ウシ血清アルブミン (BSA) 中で 4 °C で実行されました。 SFV Env 外部ドメインを細胞ペレットに 1 時間添加しました。 細胞を 2 回洗浄し、SFV Env 外部ドメインの C 末端にある strep タグを認識する StrepMAB-Classic-HRP 抗体 (7.5 μg/ml、IBA Lifesciences #2-1509-001) とともに 1 時間インキュベートし、2 回洗浄し、蛍光団AF488に結合した二次抗体（抗HRP-AF488（0.75μg/ml、Jackson ImmunoResearch、#123-545-021））とともに30分間インキュベートした。 細胞を洗浄し、PBS、2% PFA中で室温で10分間固定し、取得まで4℃に保ちました。 最低 25,000 個の細胞を CytoFLEX サイトメーター (Beckman Coulter) で取得しました。 データは、Kaluza ソフトウェア (Beckman Coulter) を使用して分析されました。 生存可能な単一細胞は、FSC-A / SSC-AおよびSSC-A / SSC-Hドットプロットにゲートを連続的に適用することによって選択されました（図S13a）。 2 つの二次抗体のみで標識した細胞を参照として使用しました。 SFV Env結合は、組換え細胞外ドメインとともにインキュベートした細胞と未処理細胞の平均蛍光強度（MFI）の比として表されました（図S13b）。

細胞をトリプシン-EDTAで処理し、条件ごとに5×105個の細胞を標識しました。 細胞をＰＢＳ、０．１％ＢＳＡで１回洗浄した後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡおよび４ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４５中でフラボバクテリウム・ヘパリナム由来の０．１ｍＩＵ／ｍｌヘパリナーゼＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｈ８８９１）とともに１５分間インキュベートした。分。 37℃で。 ヘパラン硫酸は、F58-10E4 抗体 (5 μg/ml、AmsBio、英国 #370255-S) および抗マウス IgM-AF488 抗体 (2 μg/ml、Invitrogen #A-21042) で染色して検出しました。 HS 除去によって生成されたネオアンチゲン (ΔHS) は、F69-3G10 抗体 (10 μg/ml、AmsBio #370260-S) および抗 mIgG-AF647 抗体 (4 μg/ml、Invitrogen #A-31571) で検出されました。 細胞の染色と洗浄は、PBS、0.1% BSA 中で 4 °C で実行されました。 インキュベーション時間は、一次抗体と二次抗体でそれぞれ 60 分と 30 分でした。 Env 結合について説明したように、サイトメーターの取得とデータ分析を実行しました (図 S13)。 二次抗体のみで標識した細胞を参照として使用しました。 HSおよびΔHS染色のレベルは、標識細胞と非標識細胞のMFIの比として表されました（図S13c）。

HT1080 細胞を FVV 粒子 (1、10、および 100 粒子/細胞) とともに氷上で 1 時間インキュベートしました。 細胞をＰＢＳで３回洗浄して未結合のＦＶＶを除去し、ＲＮｅａｓｙ ｐｌｕｓ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者のプロトコールに従って使用してＲＮＡを抽出した。 RT は、FVV RNA 定量化について記載されているように実行されました。 ベクター滴定について記載したように、結合した FVV を bgal 遺伝子の qPCR によって定量しました。 細胞は、以下のプライマーを使用して hgapdh 遺伝子を増幅する qPCR によって定量されました: hGAPDH_F 5' GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT 3' および hGAPDH_R 5' GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG 3'。 qPCR 反応条件は、bgal 遺伝子の増幅に使用したものと同じでした。 bgal 対 hgapdh の相対的な mRNA 発現は、-ΔΔCt 法を使用して計算され、相対結合は 2-ΔΔCt として計算されました。

感染力価、粒子濃度、感染性粒子のパーセンテージ、および WT および変異体 Env を保有する結合 FVV の量を、二元配置対応 t 検定を使用して比較しました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究で生成され、SFV GII RBDD および RBDG について決定された X 線構造に関連するデータは、それぞれ PDB アクセッション コード 8AEZ および 8AIC で RCSB タンパク質データバンクに寄託されました。 FV RBD の AF2 モデルは、次のアクセッション コードとともにモデル アーカイブ データベースに寄託されています: ゴリラ (遺伝子型 II、アクセッション コード: ma-5hiw1)、ゴリラ (遺伝子型 I、アクセッション コード: ma-sln9b)、プロトタイプ フォーミー ウイルス(チンパンジー、遺伝子型 I、アクセッション コード: ma-ogxjm)、ニシチンパンジー (遺伝子型 I、アクセッション コード: ma-zilao)、中央アフリカ チンパンジー (遺伝子型 II、アクセッション コード: ma-u3aws)、アフリカ ミドリザル (アクセッション コード: ma-mf4i2）、オランウータン（アクセッションコード：ma-kae1t）、マカク（アクセッションコード：ma-eolif）、マーモセット（アクセッションコード：ma-4q50y）、ウシ（アクセッションコード：ma-ad22f）、ウマ（アクセッションコード： ma-iodkg)、およびネコ科動物 (アクセッション コード: ma-ocsub)。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

Aiewsakun, P. & Katzourakis, A. 古生代初期のレトロウイルスの海洋起源。 ナット。 共通。 8、13954 (2017)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rethwilm, A. & Bodem, J. 泡状ウイルスの進化: すべてのレトロウイルスの中で最も古いもの。 ウイルス 5、2349–2374 (2013)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Pinto-Santini、DM、Stenbak、CR、Linial、ML 泡状ウイルスの人獣共通感染症。 レトロウイルス学 14、55 (2017)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Buseyne、F. et al. 人獣共通サル泡状ウイルスに感染したヒトにおける臨床徴候と血液検査の結果：症例対照研究。 感染症ジャーナル 218、144–151 (2018)。

CAS PubMed Google Scholar

Ledesma-Feliciano、C. et al. 猫泡状ウイルス感染症：慢性腎臓病の有無にかかわらず飼い猫における実験感染と自然感染の有病率の特徴付け。 ウイルス 11、662 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Meiering, CD & Linial, ML 泡状ウイルスの疫学と感染の歴史的展望。 クリン。 微生物。 改訂 14、165–176 (2001)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ラジャワット、YS、ハンバート、O、キーム、H.-P。 泡状ウイルスベクターを用いた生体内遺伝子治療。 ウイルス 11、1091 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

White, JM & Whittaker, GR エンドソームにおけるエンベロープウイルスの融合。 トラフィック 17、593–614 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Harrison、SC ウイルス膜融合。 ウイルス学 479-480、498-507 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Picard-Maureau, M.、Jarmy, G.、Berg, A.、Rethwilm, A. & Lindemann, D. 泡状ウイルスのエンベロープ糖タンパク質を介した侵入には、pH 依存性の融合プロセスが関与します。 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． 77、4722–4730 (2003)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

デュポン、A.ら。 泡状ウイルス融合の中間段階の特定。 ウイルス 12、1472 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rey, FA & Lok, SM エンベロープウイルスの共通特徴と次世代ワクチンの免疫原設計への影響。 セル 172、1319 ～ 1334 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Effantin、G. et al. 天然プロトタイプの泡状ウイルス糖タンパク質とウイルス構造の低温電子顕微鏡構造。 PLoS 病巣。 12、e1005721 (2016)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ウィルク、T.ら。 ヒト泡状ウイルスの完全なレトロウイルス Env 糖タンパク質は三量体です。 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． 74、2885–2887 (2000)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

パンセラ、M.ら。 三量体融合前 HIV-1 Env の構造と免疫認識ネイチャー 514、455–461 (2014)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nasimuzzaman, M. & パーソンズ, DA 細胞膜結合ヘパラン硫酸は、ヒト、サル、げっ歯類の細胞における原型泡状ウイルスの受容体です。 モル。 それで。 20、1158–1166 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Plochmann、K. et al. ヘパラン硫酸は、泡状のウイルス侵入の付着因子です。 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． 86、10028–10035 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Duda, A.、Luftenegger, D.、Pietschmann, T. & Lindemann, D. プロトタイプの泡状ウイルスエンベロープ糖タンパク質受容体結合ドメインの特性評価。 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． 80、8158–8167 (2006)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ランバート、C.ら。 人畜共通サル泡状ウイルスに感染したヒトの強力な中和抗体は、表面エンベロープタンパク質の二型ドメインに位置する保存されたエピトープを標的とします。 PLoS 病巣。 14、e1007293 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ランバート、C.ら。 サル泡状ウイルスのエンベロープ内にある免疫優勢で保存された B 細胞エピトープ。類人猿からの人獣共通感染症に感染したヒトによって認識されます。 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． 93、e00068–19 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Luftenegger, D.、Picard-Maureau, M.、Stanke, N.、Rethwilm, A. & Lindemann, D. プロトタイプ泡状ウイルスエンベロープ N グリコシル化の分析と機能。 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． 79、7664–7672 (2005)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

カーン、AS et al. スプマレトロウイルス: 分類法と命名法が更新されました。 ウイルス学 516、158–164 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Holm、L. DALI、およびタンパク質形状の持続性。 タンパク質科学。 29、128–140 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ジャンパー、J. et al. AlphaFold による高精度なタンパク質構造予測。 Nature 596, 583–589 (2021)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Aiewsakun、P. et al. サル泡状ウイルスゲノムのモジュール性とその進化の歴史。 ウイルスの進化。 5、vez032 (2019)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

リチャード、L.ら。 中央アフリカ産のゴリラおよびチンパンジーのサル泡状ウイルス株における、組換え起源である可能性のある 2 つの env 分子変異体の共循環。 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． 89、12480–12491 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, Y. & Skolnick, J. タンパク質構造テンプレートの品質を自動評価するためのスコアリング機能。 プロテイン 57、702–710 (2004)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Dong, R.、Peng, Z.、Zhang, Y. & Yang, J. mTM-align: 高速かつ正確な複数のタンパク質構造のアライメントのためのアルゴリズム。 バイオインフォマティクス 34、1719–1725 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ペッターセン、EF 他。 UCSF Chimera - 探索的研究と分析のための視覚化システム。 Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ． 化学。 25、1605–1612 (2004)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Krissinel, E. & Henrick, K. 結晶状態からの高分子集合体の推論。 Ｊ．Ｍｏｌ． バイオル。 372、774–797 (2007)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

コザコフ、D.ら。 タンパク質間ドッキング用のClusPro Webサーバー。 ナット。 プロトック。 12、255–278 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fass, D.、Harrison, SC、Kim, PS 解像度 1.7 オングストロームのレトロウイルス エンベロープ ドメイン。 ナット。 構造体。 バイオル。 3、465–469 (1996)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ファス、D. et al. 2.0オングストロームの解像度でのマウス白血病ウイルス受容体結合糖タンパク質の構造。 サイエンス 277、1662–1666 (1997)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

マッカーシー、KR 他ヒト組織で発現される内因性レトロウイルスエンベロープタンパク質である EnvP(b)1 の受容体結合ドメインの構造。 mBio 11、e02772–20 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

クォンPDほか CD4 受容体および中和ヒト抗体と複合体を形成した HIV gp120 エンベロープ糖タンパク質の構造。 Nature 393、648–659 (1998)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lindemann, D.、Hutter, S.、Wei, G. & Lochelt, M. スプマレトロ ウイルス アセンブリのユニークなもの、既知のもの、そして未知のもの。 ウイルス 13、105 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rethwilm, A. 泡状ウイルスの複製戦略。 カー。 上。 微生物。 イムノール。 277、1–26 (2003)。

CAS PubMed Google Scholar

Battini, JL、Heard, JM & Danos, O. アンホトロピック、異種指向性、およびポリトロピックマウス白血病ウイルスのエンベロープ糖タンパク質における受容体選択決定因子。 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． 66、1468–1475 (1992)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen、B. HIV-1 侵入の分子機構。 トレンド微生物。 27、878–891 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, H. et al. CD4 に結合した開いた HIV-1 エンベロープ三量体のクライオ EM 構造により、gp120 V1V2 ループの構造再配置が明らかになります。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 113、E7151–E7158 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Burton, DR & Hangartner, L. HIV に対する広範な中和抗体とワクチン設計におけるその役割。 アンヌ。 イミュノール牧師。 34、635–659 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ダイネセン、LT et al. 人畜共通サル泡状ウイルスの中和: 受容体結合ドメイン内の遺伝子型特異的エピトープ。 https://doi.org/10.1101/2022.11.06.515319 (2022)。

Burton, DR、Poignard, P.、Stanfield, RL & Wilson, IA 広範な中和抗体は、抗原的に非常に多様なウイルスに対抗する新たな可能性を提示します。 サイエンス 337、183–186 (2012)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rua, R.、Betsem, E.、Calattini, S.、Saib, A. & Gessain, A. ヒトに感染するサル泡状ウイルスの遺伝的特徴付け。 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． 86、13350–13359 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kelley, LA、Mezulis, S.、Yates, CM、Wass, MN & Sternberg, MJ タンパク質のモデリング、予測、分析のための Phyre2 Web ポータル。 ナット。 プロトック。 10、845–858 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

クレイ、T.ら。 C型肝炎ウイルスの糖タンパク質E2のジスルフィド結合は、分子の三次組織を明らかにします。 PLoS 病巣。 6、e1000762 (2010)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Backovic, M. & Krey, T. 安定したショウジョウバエ細胞株: 外因性タンパク質発現への代替アプローチ。 方法 Ｍｏｌ． バイオル。 1350、349–358 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ウェーバー、P. et al. パスツール研究所の結晶学中核施設のハイスループット結晶化パイプライン。 分子 24、4451 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

チャバス、LMG et al. Synchrotron SOLEIL での高分子結晶構造測定用の PROXIMA-1 ビームライン。 J.シンクロトロン放射。 28、970–976 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

カブシュ、W. XDS。 アクタクリスタログル。 Dバイオル。 クリスタロガー。 66、125–132 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

エバンス氏、広報、ムルシュドフ氏、GN 私のデータはどの程度優れていますか? 解像度はどれくらいですか? アクタクリスタログル。 Dバイオル。 クリスタロガー。 69、1204–1214 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Karplus, PA & Diederichs, K. 結晶学的モデルとデータ品質のリンク。 サイエンス 336、1030–1033 (2012)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ウィン医学博士ら。 CCP4 スイートと現在の開発の概要。 アクタクリスタログル。 Dバイオル。 クリスタロガー。 67、235–242 (2011)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

アダムス、PD 他。 PHENIX: 高分子構造ソリューションのための包括的な Python ベースのシステム。 アクタクリスタログル。 Dバイオル。 クリスタロガー。 66、213–221 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Terwilliger、TC et al. マップ品質のベイジアン推定を使用した構造ソリューションの意思決定: PHENIX AutoSol ウィザード。 アクタクリスタログル。 Dバイオル。 クリスタロガー。 65、582–601 (2009)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cowtan, K. 自動モデル構築用の Buccaneer ソフトウェア。 1. タンパク質鎖の追跡。 アクタクリスタログル。 Dバイオル。 クリスタロガー。 62、1002–1011 (2006)。

論文 PubMed Google Scholar

ブラン、E.ら。 BUSTER-TNT における極めて不完全な構造の可能性を最大限に高める改良。 アクタクリスタログル。 Dバイオル。 クリスタロガー。 60、2210–2221 (2004)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ブリコーニュ、G. et al. バスター。 2.8.0 edn (Global Phasing Ltd.、ケンブリッジ、2009 年)。

Emsley, P. & Cowtan, K. Coot: 分子グラフィックス用のモデル構築ツール。 アクタクリスタログル。 D 生物結晶記録装置。 60、2126–2132 (2004)。

論文 PubMed Google Scholar

マッコイ、AJ 他フェイザー結晶解析ソフトウェア。 J Appl Crystallogr. 40、658–674 (2007)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

チェン、VBら。 MolProbity: 高分子結晶学の全原子構造検証。 アクタクリスタログル。 Dバイオル。 クリスタロガー。 66、12–21 (2010)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

モッタレラ、SE et al. タンパク質上のヘパリン結合部位を特定するためのドッキング サーバー。 Ｊ．Ｃｈｅｍ． 情報モデル 54、2068 ～ 2078 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Vajda, S. et al. CAPRI によって動機付けられた ClusPro サーバーへの新規追加。 プロテイン 85、435–444 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Desta, IT、Porter, KA、Xia, B.、Kozakov, D. & Vajda, S. 剛体タンパク質間ドッキングにおけるパフォーマンスとその限界。 構造 28、1071–1081 (2020).e3。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

デラノ、WL PyMOL 分子グラフィックス システム。 (DeLano Scientific、米国カリフォルニア州サンカルロス、2002)。

Kyte, J. & Doolittle, RF タンパク質のハイドロパシー特性を表示する簡単な方法。 Ｊ．Ｍｏｌ． バイオル。 157、105–132 (1982)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ジュラス、E.ら。 APBS 生体分子溶媒和ソフトウェア スイートの改良。 タンパク質科学。 27、112–128 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

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この研究は、「Agence Nationale de la Recherche」（ANR-10-LABX62-IBEID、Intra-Labex Grant、MB）、「Institut Pasteurからの横断的研究プログラム」（PTR2020-353 ZOOFOAMENV、FB）、およびパスツール研究所 (FAR、AG) からの定期的な資金提供。 資金提供機関は、研究計画、結果の生成、または原稿の執筆において何の役割も果たしていませんでした。 パスツール研究所の Utechs サイトメトリー & バイオマーカーおよび結晶学プラットフォームのスタッフ、施設へのアクセスを許可してくれたシンクロトロン線源 SOLEIL (フランス、サントーバン)、そして親切にしてくれた Proxima 1 および Proxima 2A ビームラインのスタッフに感謝します。 X 線データ収集時の支援。 議論とアドバイスをしていただいた Jan Hellert 氏、Pablo Guardado-Calvo 氏、Philippe Afonso 氏に感謝するとともに、原稿を読んで英語の修正をしていただいた Max Baker 氏に特に感謝します。

パスツール研究所、パリ シテ大学、CNRS UMR3569、構造ウイルス学ユニット、75015、パリ、フランス

イグナティウス・フェルナンデス、リッカルド・ペデルゾーリ、デルフィーネ・ブラン、フェリックス・A・キング、マリヤ・バコヴィッチ

パスツール研究所、パリ シテ大学、CNRS UMR3569、発がん性ウイルスの疫学および病態生理学ユニット、75015、パリ、フランス

ラッセ・トフトダル・ダイネセン、ユーナ・コキン、アントワーヌ・ゲサン、フローレンス・ブセイン

パスツール研究所、パリ シテ大学、結晶学プラットフォーム-C2RT、CNRS UMR 3528、75015、パリ、フランス

アーメド・ハウズ

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MB と FB がこの研究を考案し、監督しました。 IF と LTD が実験の大部分を実行しました。 IF は AH を利用して RBD を結晶化し、X 線回折データを収集し、RP で構造を解析し、ヘパリン セファロースカラムを使用して結合研究を実行しました。 LTD は、細胞に関するすべての結合研究を実施しました。 YC は、感染アッセイで Foamy ウイルス ベクター粒子を生成および評価しました。 DB は継続的な技術支援を提供しました。 元の原稿草案は IF、RP、LTD、YC の協力を得て MB によって書かれ、レビューと編集は MB、IF、LTD、FB、FAR によって行われました。資金は MB、FB、FAR、とAG

マリヤ・バコヴィッチへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Wanhong Liu と他の匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

フェルナンデス、I.、ダイネセン、LT、コキン、Y. 他サルのフォーミーウイルス受容体結合ドメインの結晶構造は、宿主細胞への侵入に関する手がかりを提供します。 Nat Commun 14、1262 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-36923-0

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受領日: 2022 年 9 月 30 日

受理日: 2023 年 2 月 21 日

公開日: 2023 年 3 月 6 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36923-0

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